子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响.docx

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响[摘要]目的：采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养，观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法：对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定，然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养，观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果：与无上皮细胞相比，共培养明显促进了小鼠桑椹胚率，囊胚率，囊胚孵化率和胚胎总细胞数。结论：子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育，对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。[关键词]子宫内膜上皮细胞；共培养；体外受精；小鼠EffectsofCocultureofMouseEmbryowithEndometrialEpithelialCellsonEarlyMouseEmbryonicDevelopmentAbstract:ObjectiveToobservetheeffectsofcocultureofmouseembryowithendometrialepithelialcellsonearlyembryonicdevelopmentinMouseendometrialepithelialcellswereisolatedandcultured,thenitwascoculturedwithmouseembryosfertilizedinvitro.Thepercentageofembryocleavage,blastocysthatchingandtotalcellnumberofblastocystwereobserved.ResultsCoculturewithendometrialepithelialcellscouldpromotetheformationofmousemorula(%and%,)andblastocyst(%and%,),andincreasetheblastocysthatchedrate(%and%,)andtotalcellnumberofblastocyst(and,).ConclusionCoculturewithendometrialepithelialcellscanfacilitatethedevelopmentofearlymouseembryoinvitro,whichcanoptimizetheconditionofembryonicdevelopmentinvitro.Keyword:Endometrialepithelialcells;Coculture;Invitrofertilization;Mouse早期胚胎发育是一个极其复杂的过程，受到多种因素的影响。在生殖医学等多个领域，胚胎体外培养技术已得到很大的提高，胚胎与体细胞共培养因其能够克服体外发育阻滞、提高移植后胚胎着床率[1]等优势而成为一种有效的胚胎体外培养途径。共培养的方法很多，其中以采用雌性生殖道细胞的效果最佳[2,3]。为进一步研究体细胞对胚胎体外发育环境的影响，本实验采用小鼠子宫内膜上皮细胞和早期胚胎进行共培养，观察其对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。1材料与方法材料实验动物:15只20g的昆明雌性小鼠购于中国科学院遗传与发育所实验动物中心。实验动物房光、暗周期均为12h，饲养温度为24℃~26℃，自由采食饮水。试剂:DMEM培养基；胎牛血清；孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素(宁波激素制品厂)；兔抗人角蛋白多克隆抗体；生物素标记的羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Zymed公司);实验中其余所用化学药品和试剂购自Sigma公司。方法小鼠子宫内膜上皮细胞的分离培养:根据Wegner等人报道的方法从小鼠子宫组织中分离上皮细胞。调整细胞密度为5×105/ml，细胞以ml/孔接种于24孔培养板中，置入37℃、95%湿度、5%CO2培养箱中培养。次日下午每孔更换ml新鲜培养液，以后隔天换液一次。在接种后第5~6天，细胞完全生长汇合时，收集细胞进行冷冻保存。细胞的免疫染色:复苏的上皮细胞直接接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，放入培养箱中培养。待细胞单层形成后取出玻片，预冷的PBS漂洗，4%多聚甲醛室温下固定30min，3%的H2O2孵育30min，10%的正常羊血清封闭40min；加一抗，4℃孵育过夜；添加生物素标记羊抗兔的IgG，室温下孵育2h；添加辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素，室温下孵育2h；DAB显色，苏木精复染，封片。阴性对照采用PBS代替一抗，其它步骤相同。小鼠体外受精及胚胎培养:昆明小鼠体外受精和卵裂所用培养液分别为HTF和mKSOM，体外受精方法参见王敏康等人的报道。受精后体外培养24h，均等卵裂为2-细胞者判定为受精卵。冷冻细胞复苏后接种于96孔培养板，体外培养3d。共培养前用