CIK细胞对乳腺癌细胞株抗增殖及诱导凋亡的作用.docx

CIK细胞对乳腺癌细胞株抗增殖及诱导凋亡的作用【摘要】目的研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)对ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制。方法应用MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果MTT比色法表明随着CIK细胞与乳腺癌细胞效靶比增加及作用时间延长，抑制率明显增强。CIK细胞作用于乳腺癌细胞24h后，形态学观察乳腺癌细胞发生凋亡或坏死。结论CIK细胞是一种新型高效具有较强杀伤体外乳腺癌细胞的免疫活性细胞。【关键词】CIK细胞ZK751乳腺癌细胞抗肿瘤细胞凋亡0引言从80年代Rosenberg等观察到在患非免疫系统肿瘤的动物中给予重组白细胞介素2，动物的淋巴细胞可以调节肿瘤的消退和转移以来，细胞免疫治疗就迅速扩展开来，人们先后研究了淋巴因子激活的杀伤细胞，肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞，CD3单抗激活的杀伤(CD3AK)细胞，但是由于细胞来源困难、细胞扩增倍数低或者细胞毒力不高等原因，上述细胞的临床应用受到极大限制。为此，美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心1991年首先报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)细胞[1]。目前，国内尚未见应用CIK细胞体外诱导肿瘤细胞凋亡的形态学观察和机制探讨。本课题通过光镜、电镜观察了CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株作用的形态学变化。1材料与方法材料药品及试剂基因重组人IL2、鼠抗人CD3McAb、淋巴细胞分离液、基因重组人IFNγ、RPMIMedium1640培养基、IMDM培养基、胎牛血清、MTT。肿瘤细胞ZK751乳腺癌细胞株由西安医科大学肿瘤研究所提供，由本科室体外传代培养。方法效应细胞制备取健康者的成分白细胞用淋巴细胞分离液经Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞，此细胞被重悬并保存于IMDM培养液中。调至１×10６个/ml，第0d加入IFNγ2000u/ml，PHA100μg/ml放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h，第1d加CD3McAb5μg/ml,重组人IL21000u/ml,继续培养。每3d半量换液，同时补加IL21000u/ml，PHA100μg/ml调细胞浓度至１×10６个/ml，第14d收获细胞。MTT法测量细胞存活率取对数生长期乳腺癌细胞％台盼蓝染色及计数，调整浓度至1×105个/ml细胞悬液为靶细胞，取培养14d的CIK细胞调整浓度为１×10６个/ml为效应细胞。按10∶1、20∶1、30∶1的效靶比混合加入96孔板，另设单独效应细胞组及单独靶细胞组为阴性对照组、每组重复8孔，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h、48h后取出，每孔加MTT20μl(5mg/ml),继续培养4h后小心弃去上清液，加入二甲基亚砜160μl,轻轻振荡10min后用酶联免疫检测仪λ＝490nm测吸光度值，杀伤率计算公式为：抑制率＝[１－(实验孔A值－效应孔A值)/靶细胞孔A值]×100%倒置显微镜观察将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于24孔培养板内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，随时在倒置显微镜下观察。设对照组为单纯培养的乳腺癌细胞。HE染色观察将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于已放置支持物小盖片的12孔培养板内。对照组：加等量生理盐水。连续培养24h后取出小盖片。将小盖片用4％多聚甲醛固定30min后，水洗3min，苏木素2min，水洗3min，％盐酸酒精8s，水洗15min，90％乙醇5min，伊红30s，脱水、透明及封固。透射电镜观察将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1混合的4、12及24h细胞离心，弃去上清液，剩下的细胞团用%戊二醛固定、梯度丙酮脱水;Epon812混合树脂包埋;超薄切片机切片;醋酸钠和柠檬酸铅染色;透射电镜观察、照相。统计学处理应用软件：进行统计学处理，MTT法检测的抑制率之间的比较采用t检验。2结果MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞的抗增殖及细胞毒结果随着效靶比增加及作用时间延长，其细胞毒性明显增强。相同作用时间不同效靶比之间有显着性差异，同一效靶比不同作用时间之间也有显着性差异。当效靶比为30∶1时，其抑制率为%±%，接近半数抑制浓度，有效作用时间为24h，见表1。表1用MTT法测定CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抑制率Note:ComparedwiththeformeratthesametimeΔ;Comparedwiththeformeratthesametime*;Comparedwiththe