甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究.docx

甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究【摘要】目的:构建真核表达重组质粒(+)M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2eCtB定向克隆入真核表达载体(+)中,再转化JM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为(+)M2e/CtB。用KEGENTRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒(+)M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RTPCR产物序列分析、Westernblot检测其稳定表达产物。结果:重组质粒(+)M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒(+)M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。【关键词】甲型流感病毒M2e黏膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位融合蛋白[Abstract]AIM:Toconstructtheeukaryoticrecombinantplasmid(+)M2e/CtBwhichcontainsH1N1M2egeneandcholeratoxinBsubunitgene(CtB)andtostudytheexpressionandimmunityofrecombinantproteinM2e/CTBinNIH3T3cells.METHODS:M2e/CtBgenewasclonedbyPCRanddigestedwithHindⅢandXhoⅠ.M2e/CtBwaslinkedinto(+)tobuildeukaryoticexpressionplasmid(+)M2e/CtB.The(+)M2e/CtBwastransferedintocompetentJM109.ThetransformedcolonieswereverifiedbyHindⅢandXhoⅠ,PCR,andsequencing.TheNIH3T3cellsweretransfectedwith(+)M2e/CtBbypositiveionpolymer.TheproductofM2e/CtBgenewithstableexpressionwasanalysedbyimmunofluorescence,RTPCRsequencing,andWesternblot.RESULTS:Thedigested(+)M2e/CtBcontainscorrectM2eandCtBgene.BlastnresultsshowedthegenetichomongenicityofM2eandCtBwere100%,respectively.The(+)M2e/CtBefficientlyexpressedM2e/CTBproteinintheeukaryoticNIH3T3cells.ThecelllysisandsupernantbothcontainedtheM2e/CTBprotein,whichhadtheimmunityandreactivitytobothantiM2eandantiCTB.TheMrofM2e/CTBproteinwasabout18000analysedbyWesternblot.CONCLUSION:Anewrecombinanteukaryoticplasmid(+)M2e/CtBhasbeensuccessfullyconstructed.TheplasmidcanexpressthefusedproteinofM2ewithCTB.OurstudywillhelpfurtherresearchintonewandeffectiveDNAvaccinesagainstinfluenzavirusA.[Keywords]influenzavirusA;M2e;mucousimmunoadjuvant;CTB;fusedprotein自1918年世界流感大流行以来,流感病毒仍持续对人类健康造成危害,对经济造成重大损失。流感疫苗一直是人们依赖的抗流感武器,但遗憾的是现有疫苗多以当前流行的流感病毒为防疫对象,一旦流感病毒发生变异,这些疫苗也无济于事。因此研发一种能防治多株流感病毒的保护性疫苗迫在眉睫。流感病毒有3种膜蛋白,分别是血凝素(HA),神经氨酸酶(NA),基质蛋白(M2),其中仅HA和NA均易发生变异