猪流行性腹泻病毒.docx

猪流行性腹泻病毒猪流行性腹泻病毒猪流行性腹泻病毒猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus,PEDV）简介猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率．PEDV是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA5'端有帽结构(cap)，3'端有Poly(A)尾，基因组全长为28033bp，基因组结构如图所示．5'端的2/3部分编码2个大的复制酶多聚蛋白ppla和pplab，其余1/3基因组序列包括5个ORF，编码4个结构蛋白:纤突蛋白(S)、小包膜糖蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)以及ORF3编码的1个非结构蛋白．复制周期首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。蛋白组成纤突蛋白（Spikeprotein，S）小包膜蛋白（Envelopeprotein，E）膜糖蛋白（Membraneprotein，M）核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，N）ORF3编码的多肽非结构蛋白（nonstructuralprotein）Nsp1Nsp2Nsp3Nsp4Nsp5Nsp6Nsp7Nsp8Nsp9Nsp10Nsp11Nsp12Nsp13Nsp14Nsp15依赖于RNA的非结构蛋白pol基因编码（复制酶多聚蛋白lab，pplab）病毒分离方法一病毒粗提从无PED病史的健康母猪场取生后2d的新生仔猪,移入人工哺乳室人工喂奶,观察2d,4日龄时口服华株病毒,24h左右发病(水泻、部分猪呕吐)。扑杀病猪,取出小肠,轻轻挤去内容物,将其纵向剪开,刮取小肠粘膜混合之,用pH7.4的0.01mol/LPBS(含0.15mol/LNaCl,1mmol/LEDTA-Na2)作1∶10稀释,反复冻融3次,7000×g离心30min,取上清,加PEG-6000(40%)和NaCl至终浓度分别为6%和2%,4℃过夜后,7000×g离心30min,取沉淀,以PBS悬浮12h以上。将重悬液15000×g离心30min,取上清,140000×g4℃超速离心120min,以PBS重悬沉淀,重复差速离心1～2轮次。将沉淀用少量PBS充分悬浮,即得粗提病毒。病毒精提将病毒粗制剂进行蔗糖(15%～55%)密度梯度离心,100000×g离心2h。以长弯针头自下而上吸取各带少许,电镜观察纯度,并用紫外分光光度计测定抗原蛋白浓度,用ELISA测定病毒效价。取纯度高、活性强的样品,对PBS或Tris-HCl-EDTA(TE)透析48h,即得病毒纯化制剂,作为免疫和检测用抗原方法二取病死猪肠系膜淋巴结和己脱落的肠黏膜剪碎，置于无菌的研钵中，滴加5-10倍体积的生理盐水，反复研磨20min，反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素(1000U/mL)链霉素(300U/mL)37℃水浴1h;之后经4000r/min离心30min，取上清用0.22um的滤膜过滤之后用灭菌的EP管收集或直接取0.6mL接种在含有10%血清的MEM培养液中己长成单层的PK-15细胞，每隔6-l0h观察细胞病变。疫苗研发灭活疫苗（组织灭活疫苗和细胞灭活疫苗）优点：组织灭活苗效果好，应用最