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猪流行性腹泻病毒
猪流行性腹泻病毒
猪流行性腹泻病毒
猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus,PEDV）
简介
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率．
PEDV是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA5'端有帽结构(cap)，3'端有Poly(A)尾，基因组全长为28033bp，基因组结构如图所示．5'端的2/3部分编码2个大的复制酶多聚蛋白ppla和pplab，其余1/3基因组序列包括5个ORF，编码4个结构蛋白:纤突蛋白(S)、小包膜糖蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)以及ORF3编码的1个非结构蛋白．

复制周期
首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。
首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。
蛋白组成
纤突蛋白（Spikeprotein，S）
小包膜蛋白（Envelopeprotein，E）
膜糖蛋白（Membraneprotein，M）
核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，N）
ORF3编码的多肽
非结构蛋白（nonstructuralprotein）
Nsp1
Nsp2
Nsp3
Nsp4
Nsp5
Nsp6
Nsp7
Nsp8
Nsp9
Nsp10
Nsp11
Nsp12
Nsp13
Nsp14
Nsp15
依赖于RNA的非结构蛋白pol基因编码（复制酶多聚蛋白lab，pplab）
病毒分离
方法一
病毒粗提
从无PED病史的健康母猪场取生后2d的新生仔猪,移入人工哺乳室人工喂奶,观察2d,4日龄时口服华株病毒,24h左右发病(水泻、部分猪呕吐)。扑杀病猪,取出小肠,轻轻挤去内容物,将其纵向剪开,刮取小肠粘膜混合之,用pH7.4的0.01mol/LPBS(含0.15mol/LNaCl,1mmol/LEDTA-Na2)作1∶10稀释,反复冻融3次,7000×g离心30min,取上清,加PEG-6000(40%)和NaCl至终浓度分别为6%和2%,4℃过夜后,7000×g离心30min,取沉淀,以PBS悬浮12h以上。将重悬液15000×g离心30min,取上清,140000×g4℃超速离心120min,以PBS重悬沉淀,重复差速离心1～2轮次。将沉淀用少量PBS充分悬浮,即得粗提病毒。
病毒精提
将病毒粗制剂进行蔗糖(15%～55%)密度梯度离心,100000×g离心2h。以长弯针头自下而上吸取各带少许,电镜观察纯度,并用紫外分光光度计测定抗原蛋白浓度,用ELISA测定病毒效价。取纯度高、活性强的样品,对PBS或Tris-HCl-EDTA(TE)透析48h,即得病毒纯化制剂,作为免疫和检测用抗原
方法二
取病死猪肠系膜淋巴结和己脱落的肠黏膜剪碎，置于无菌的研钵中，滴加5-10倍体积
的生理盐水，反复研磨20min，反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素(1000U/mL)链霉素(300U/mL)37℃水浴1h;之后经4000r/min离心30min，取上清用0.22um的滤膜过滤之后用灭菌的EP管收集或直接取0.6mL接种在含有10%血清的MEM培养液中己长成单层的PK-15细胞，每隔6-l0h观察细胞病变。
疫苗研发
灭活疫苗（组织灭活疫苗和细胞灭活疫苗）
优点：组织灭活苗效果好，应用最为广泛，细胞灭活苗制备方便，应用也越
来越广泛
缺点：灭活苗产生完全免疫力需要2周时间，且剂量偏大，安全性
细胞弱毒苗
可应用PEDV细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪，从而有效预防PED