质粒DNA的提取及检测实验报告.pdf

四川大学实验报告题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。二．实验原理1.质粒(Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。3.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，2%SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性1/9四川大学实验报告（3）溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。三．实验材料及设备1.实验材料：（1）含质粒pUC18大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，EP管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）；（2）提取的pUC18，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。实验设备：2.实验仪器：2/9四川大学实验报告（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。3.实验试剂：（1）质粒的提取a.LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5;b.溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；c.氨苄青霉素(50mg/mL)；d.抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。e.无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。f.70%乙醇作用：纯化质粒DNA。g.TE缓冲液或ddH2O作用：溶解DNA3/9四川大学实验报告（2）DNA琼脂糖凝胶电泳检测a.Goldview（DNA染料）b.1×TAE缓冲液c.上样缓冲液（6×）四．实验方法及步骤1.质粒DNA的提取a)将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），370C培养过夜；b)取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液；c)加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min；d)加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min；e)加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min；f)10000rpm×5min，取上清液于另一干净的离心管中；g)向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm×10min，将上清液转移至新的离心管中；4/9四川大学实验报告h)加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm×2min,取上清液于新离心管中；i)向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h；j)12000rpm×5min，倒去上清液，吸干液体；k)加800μL70%乙醇，离心12000rpm×1min，倒尽上清