纳他霉素发酵生产实验报告.pdf

生物工程082纳他霉素的发酵生产、别离纯化及检测〔广州大学生物工程系，广州510006〕摘要：本实验利用褐黄孢链霉菌斜面菌种，先取约5个接种环的斜面菌种无菌接种到2瓶种子液体培养基中培养24小时，再分别在无菌条件下用移液枪吸取1mL种子培养基转接到6瓶发酵培养基，摇瓶发酵48小时后，连续3天吸取菌液进行镜检，菌液OD值测定，并利用500μg/mL的纳他霉素按照0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL加入量制定标准曲线；摇瓶发酵5天后，合并发酵液，离心获得菌泥，采用2倍菌泥体积的95%酒精，pH值在10~10.5搅拌溶解纳他霉素；离心保留上清液，上清液在Ph值在6.5，冰箱静置3h，纳他霉素在等电点析出；离心，保留产物；产物在55℃真空干燥2h，称重获得0.08g的纳他霉素。关键词：褐黄孢链霉菌；种子培养基；发酵培养基；等电点溶解；真空干燥引言：纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，其外观白色〔或奶油色〕，为无色、无味的结晶粉末，分子式，分子量为。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶C33H47NO13665.73于大部分有机溶剂。在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高。纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温〔100℃〕；但由于它具有环状化学结构、对紫外线较为敏感，故不宜与阳光接触。纳他霉素活性的稳定性受PH值、温度、光照强度和氧化剂及重金属的影响，所以产品应该防止与氧化物及硫氢化合物等接触[]。纳他霉素(Natamycin)是由一种纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)发酵产生的一种二十六元多烯大环内酯类抗生素,能有效地抑制和杀死霉菌及酵母菌,是一种安全、低毒、高效、广谱的抗真菌抗生素和天然的生物防腐剂[1]与其它抗菌产品相比,纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低,可广泛应用于由真菌引起的疾病.除此之外,纳他霉素的低溶解度,可用其对食品外表进行处理以增加食品的保质期,不影响风味和口感.目前,全球有30多个国家批准将纳他霉素用于乳制品、肉制品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏[2]。纳他霉素的需求量增加,市场前景巨大。纳他霉素主要由恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanovgensis)、纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatu2lonso)和褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)产生。在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源。纳他霉素在以葡萄糖最为碳源时产量最高[3]。因为葡萄糖能够渗入纳他霉素分子之中[3]。氮源类型对纳他霉素的产量有较大的影响。有资料说明，菌体细胞生长最好的氮源是酵母提取物，而纳他霉素产生的最正确氮源为牛肉浸出物[3]。1.1材料：1.1.1发酵菌种：褐黄孢链霉菌，生物工程0821.1.2培养基：1.1.3实验试剂：酵母提取粉，葡萄糖，琼脂，蛋白胨，氯化钠，大豆别离蛋白，麦芽糊精，酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化剂BHA，1，2-丙二醇，纳他霉素标准品；1.1.4实验仪器：250mL三角瓶，摇床，生化培养箱，离心机，紫外分光光度计。1.2方法：1.2.1孢子的制备：按斜面孢子培养基配方准确配好培养基，121℃灭菌15min,摆斜面冷却后置于37℃培养1～2d，备用，用斜面转接管接种，25℃培养10d，待孢子长满后，放置冰箱5d以上再用。涂片观察孢子形态，并显微拍照。摇瓶种子制备：按摇瓶种子培养基配方准确配好培养基200mL，平分装在两个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。29℃，200r/min振荡培养24h，无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。1.2.3摇瓶发酵：按摇瓶发酵培养基配方准确配培养基600mL,平分装在6个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。待培养基冷却后，取摇瓶种子1mL接种，29℃，200r/min振荡培养120～168h。每隔24h无菌取样，取1mL发酵液用于测量其303nm处OD值，另取少量涂片观察形态，并显微照相。的测量方法：从接种后第48h开始，每隔24h从其中一瓶中取0.5mL发酵液，加入4.5mL303的丙二醇，在摇床上震荡1h，12000r/min离心10min，取0.5mL上清液，再加4.5mL蒸馏水，摇匀，用紫外分光光度计在波长303nm处测定光密度。1.2.5标准曲线的制作：取50mg纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500ug/mL的纳他霉素原液。按表1制作曲线，