条件性基因敲除与敲入专家讲座.pptx

在科学研究中，为了明确某一组织或器官功效，常将试验动物体内所要研究组织或器官切除，进而依据试验动物生理指标或功效改变来推测切除部分功效。生命科学发展到今天，人们对于生命现象认识已经逐步深入到了分子水平，而上述“部分切除—观察整体—推测功效”研究思想依然有效。详细地说，就是在分子水平破坏想要研究基因，然后观察生物体生理指标、功效、整体形态、组织结构、发育过程改变等，进而推测对应基因功效。这种研究过程称为基因敲除(geneknockout)。另外，为了研究某种疾病与某个基因之间关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后观察试验动物出现各种改变，从而推测疾病与基因关系，这种研究方法称为基因敲人(geneknockin)。实现基因敲除方法有各种，但基本上都是采取同源重组或随机整合方法，让一段没有生理功效DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基因功效。基因敲除主要是在胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESC)水平进行操作。胚胎干细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立全能细胞系，在体外培养时保持了未分化状态，能够传代增殖，在发育上类似于早期胚胎细胞团细胞，含有与早期胚胎细胞相同分化潜能和正常整倍体核型两大特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制理想模型。首先在这种细胞内进行分子水平基因操作，之后再使这种已经发生了基因改变细胞发育成为一个完整生物体。这么就能够在整个生物体内实现预期基因改变。经典基因敲除详细实施方法能够简述以下：选择需要研究目标基因部分或全部DNA片段，经过分子生物学方法使其产生突变，然后与对应载体进行重组，成为靶载体。分离试验动物胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相同或相同序列进行同源重组，替换细胞内原来基因。经过一定筛选方法筛选出发生同源重组细胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理囊胚重新植入到假孕小鼠子宫内，使其发育成为一个完整个体。含有对应突变基因嵌合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，经过筛选可取得携带该突变基因纯合子小鼠。经过上述方法所取得基因敲除小鼠模型，其身体各种组织、器官以及小鼠生存各个时期都携带有突变基因，对应基因功效也发生了改变。这是一个非常经典基因敲除方法，该方法对说明一些基因功效做出了十分主要贡献。不过，对于一些特殊基因，该方法往往显得无能为力，这些基因在胚胎发育过程中或者在成熟生物体内含有至关主要功效。当这些基因突变后，胚胎往往不能发育至正常分娩，或者即使能够出生也会因为过于严重生理缺点而过早夭亡，无法开展后续研究，或者这些基因突变后影响到试验动物繁殖功效而不能产生后代，进而不能取得携带突变基因纯合子动物模型。针对上述问题，近年来出现了一个特殊基因敲除或敲入方法，被称为条件性基因敲除或敲入(conditionalgeneknockoutorknockin)。这种方法是指在特定组织细胞或者细胞发育特定阶段敲除某一特定基因试验技术。其优势在于克服了经典基因敲除伎俩所碰到上述问题，对于在特定组织细胞和(或)特定时间研究特定基因功效，以及更加好地建立人类疾病动物模型都含有十分主要意义。一、条件性基因敲除策略——Cre/loxP重组系统1．Cre/loxP系统原理loxP（locusofX-overP1）序列：起源于P1噬菌体，是由两个13bp反向重复序列和中间间隔8bp序列共同组成，8bp间隔序列同时也确定了loxP方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp反向重复序列是Cre酶结合域。其序列以下：Cre重组酶介导两个loxP位点间重组是一个动态、可逆过程，能够分成三种情况：1、假如两个loxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间序列；2、假如两个loxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能造成两个loxP位点间序列倒位；3、假如两个loxP位点分别位于两条不一样DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链交换或染色体易位。条件性基因敲除与敲入专家讲座2．Cre/loxP系统优点3．Cre/loxP系统工作流程第二只转基因小鼠普通采取卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术取得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因开启子调控之下，能够使其在某特定条件下表示。最终，让这两只小鼠进行交配，产生同时含有上述两种基因型子代小鼠就会在某一特定类型细胞中缺失某一特定基因。很显著，在何种组织细胞或器官中敲除某一特定基因取决于所选择开启子。只要选择适当开启子调控Cre重组酶表示，使其在生物体特定部位、特定条件下产生，就能够实现对应条件下某一特定基因敲除。条件性基因敲除与敲入专家讲座迄今为止，研究者们已经成功地利用多个不一样开启子实现了在不一样条件下基因敲除，这些开启子能够是细胞类型特异，如lck