质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告.doc

质粒ＤNA得提取、定量、酶切与ＰＣＲ鉴定
一、实验目得
１、学习并掌握用碱裂解法提取质粒ＤNA得方法;
2、学习并掌握了解质粒酶切鉴定得方法;
３、学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度与纯度得原理与方法;
4、学习并掌握PＣR基因扩增得实验原理与操作方法；
5、学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳得原理与使用方法.
二、实验原理
1、PCR（多聚酶链式反应)
在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以ｄNTＰ为原料,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外(缓冲液中）复制DＮA,使目得DNA按２ｎ方式呈指数形式扩增。
PＣR一次循环得具体反应步骤为：
A、变性：加热反应系统至9５℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
Ｂ、退火:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温（3５—70℃，一般低于模板Tm值得５℃左右）,与模板DNA互补退火形成部分双链.
C、延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Ｔaq酶作用下，以dNＴP为原料,引物为复制起点，模板DＮA得一条单链在解链与退火之后延伸为一条双链。
2、质粒DNＡ得提取与制备
(1)、碱裂解法：
染色体DNＡ与质粒DNＡ得变性与复性存在差异:
A、高碱性条件下，染色体DNA与质粒DNA均变性;
B、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性得质粒DNＡ复性并保存在溶液中,染色体ＤNA不能复性而形成缠连得网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
（２）、离心层析柱：
Ａ、硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中得质粒ＤNA，而不吸附溶液中得蛋白质与多糖等物质；
B、通过去蛋白液与漂洗液将杂质与其它细菌成分去除;ﻭC、低盐，高ｐH值得洗脱缓冲液将纯净质粒ＤNＡ从硅基质膜上洗脱.
质粒DＮA得定量分析（紫外分光光度法):
A、物质在光得照射下会产生对光得吸收效应，且其对光得吸收就是具有选择性；
B、各种不同得物质都具有其各自得吸收光谱：
DNA分对波长260nm得紫外光有特异得吸收峰
蛋白质对波长２80nm得紫外光有特异得吸收峰
碳水化合物对23０ｎm得紫外光有特异得吸收峰
C、A260/A2８0及Ａ２６0／A23０得比值可以反应DNA得纯度;
A2６0／Ａ２８0＝1、８DＮＡ纯净
A２６０/A２80＜1、8表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质
A26０/A280〉1、8含RNA杂质,用RＮA酶去除。
质粒ＤNA得酶切鉴定:
限制性内切酶就是DNA重组操作过程中所使用得基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列得特殊ＤNA序列结合，或就是与其附近得特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。
琼脂糖凝胶电泳：
琼脂糖就是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性得滤孔，凝胶孔径得大小决定于琼脂糖得浓度.
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNＡ分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应：不同得DNA，分子量大小及构型不同,电泳时得泳动率就不同，从而分出不同得区带（迁移速度与分子量得对数值成反比关系）、
三、材料与方法：
（一）实验材料：
1、PＣR
仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌得薄壁离心管
材料：菌液【大肠杆菌DH5ａ菌株（pMD19-Ｔ质粒,含目得片段－绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、２×PｒemixTaq、引物
2、质粒DNＡ得提取与制备
仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendｏrf管、微量加样枪、离心管
材料：溶液Ｐ1(S1）、溶液P2（S2)、溶液P3（S３）、去蛋白液PE（Ｗ１）漂洗液WB（Ｗ2）、洗脱液EB（Eｌuent）、含pＭD1９-T质粒得大肠杆菌ＤH５α
3、质粒DNA得定量（紫外分光光度法)
仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪
材料:蒸馏水、质粒ＤＮA
4、质粒ＤNA得酶切鉴定
仪器：1、５mｌ得EP管、微量加样枪
材料：无菌水、1０×Ｍ酶切缓冲液BuｆR、质粒DNA、HindIＩI（1５Ｕ/ul）、EcoRI(1２Ｕ/ul)
5、琼脂糖凝胶电泳
仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统
材料:电泳指示剂、Ｇｅｌｖiew、TＢE、琼脂糖、DNAＭａｒｋer５０00、电泳缓冲液
（二）实验方法
准备目得DNA:菌液煮沸10min,冷冻,室温解冻后离心取上清液
1、PCR
取0、2mlPCR反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入:灭菌去离子水5、5μl、2*PremixTaq12、5μl、引物1(10mol/L)1μl、引物2(10mol/L)1μl、菌液5μl

将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心

将装有PCR反应体系得PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作:
=1\*GB3①94℃预变性5分钟后开始以下循环=2\*GB3②循环为94℃——30秒,50℃