重组DNA导入宿主细胞与转化子的筛选专家讲座.pptx

重组DNA导入宿主细胞与转化子筛选?第一节重组DNA向宿主细胞导入第二节转化子筛选与判定第三节目标基因序列测定第一节重组DNA向宿主细胞导入一、转化:以质粒作为克隆载体将目标基因导入宿主细胞㈠原生质体转化法:除去细胞壁后加外源DNA，经吸收恢复再生培养，如枯草杆菌。㈡化学转化法:1970年Mandel和Higa首先用CaCl2经短暂热休克后，可使外源DNA转入E.coli。1.原理：将对数生长久细菌在0℃下,用预冷CaCl2溶液低渗处理,以使菌体细胞壁和细胞膜通透性增加,菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌细胞内。用冷CaCl2低渗处理E.coli使菌体成球形，外源DNA被吸附，经短暂42℃热休克，易于进入胞内而不被降解，转化效率达105-106，它与菌株（hsdR-).2.方法:（1）感受态细菌制备（2）转化（1）感受态细菌制备接种一环DH5于2mlLB中37℃，振荡过夜以约1%接种量接入20mlLB中振荡培养约90’至OD600≈0.2离心（5K，5’）搜集菌体加入预冷CaCl2（10ml100mM）冰浴20’离心搜集菌体加入100ul100mM预冷CaCl2混匀转化项目㈢电穿孔法原理：利用高压脉冲电场,在宿主细胞表面形成暂时性微孔,质粒DNA可乘隙而入,在脉冲过后,微孔复原。它比CaCl2法操作更简单，转化效率高（普通可达109～1010个转化子／μgDNA）,不但无需制备感受态细胞,而且适合用于任何菌株。二、经过接合作用传递质粒DNA接合----F+×F－三、经过转染/转导作用传递遗传物质㈠转染病毒（含噬菌体）DNA及其重组子DNA导入宿主细胞（或细菌）过程称转染。㈡转导以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌过程称转导。原理：1.重组外源基因噬菌体DNA,体外包装成噬菌体，感染宿主菌，同时导入外源基因。2.噬菌体主动感染将含有外源DNA片段重组噬菌体DNA导入宿主菌体内第二节转化子筛选与判定一、利用遗传标志表型特征筛选二、依据重组子结构特征筛选一、利用遗传标志表型特征筛选Ampicillin抗性?yesyesTetracycline抗性?Noyesback编码b-半乳糖苷酶非重组质粒:不含有插入DNA蓝色菌落重组质粒:含有插入DNA:白色菌落α-互补原理二、依据重组子结构特征筛选1.重组子大小判别筛选菌落——提取质粒——单酶切——电泳原质粒2.酶切判定菌落——提取质粒——双酶切——电泳原质粒3.PCR筛选法能与插入基因片断两端互补特异引物,以少许抽提重组子DNA为模板,进行PCR分析4.原位杂交图5-3、5-4该法是从基因组文库中筛选目标基因首选方法。5.斑点杂交1)重组体DNA或RNA抽提出来,麻烦2)抽提纯化,蛋白质、杂DNA等降低,所以能得到更为确切结果,既可用于定性,对拷贝数进行相对定量。6.Southernblot杂交法原位杂交与斑点杂交都只能判定整个重组子中是否会有与探针互补同源片段,而Southernblot杂交能将同源片断定位于基因同尾酶BamHI和BglII第三节目标基因序列测定一、目标基因序列测定意义二、目标基因测序方法酶法——双脱氧链末端终止法①双脱氧－M13体系DNA序列分析法M13含单链DNA，在细菌内形成双链环状DNA（RF）。成熟噬菌体含单链DNA分泌到培养液中。双链DNA（RF）：克隆载体，按提取质粒方法从细菌中制备单链DNA：测序模板，从培养基上清中提取当前惯用M13mp18图5-6㈡化学（裂解）法在无NaCl下，用联氨（肼）可打开C、T碱基，在C、T碱基发生断裂，形成T+C组。加入NaCl，肼切割C形成C组。在中性条件下，硫酸二甲酯可在G处断开形成G组。加入甲酸可在A、G处断开，形成G+A组，最终电泳经感光读片，自动分析得到测序结果。如、图5-95-10全自动DNA测序仪末端终止法，采取4种荧光染料标识ddNTP，在同一泳道测序，为人类基因组测序做出重大贡献。