重组DNA药物医学知识专家讲座.pptx

第七章重组DNA药品优点：1、可大量生产过去难以取得生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质不足之处2、提供足够数量生理活性物质，以进行生理生化、结构研究3、利用基因工程技术可发觉、挖掘更多内源性生理活性物质4、取得新型化合物主要基因工程产品研制、开发、上市时间DNA重组药品制造主要步骤二、基本过程1、目标基因取得4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）经典PCR反应包含①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。化学合成法在已知DNA序列或多肽普通结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2、基因表示优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表示、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性真核酵母：研究基因表示调控最有效单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代时间短；无毒；有分泌功效和修饰功效；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药品生产。丝状真菌：有很强蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相同，有成熟发酵和后处理工艺哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻大肠杆菌与真核细胞表示系统比较大肠杆菌表示重组蛋白易形成包含体蛋白质复性概念2）、表示载体要求：a、能独立复制b、有灵活多克隆位点和方便筛选标识c、含有有效运载外源基因能力，能携带大小不一样外源基因d、轻易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。如大肠杆菌pBV220系统，为温度诱导表示载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系统，最有潜力系统，可用乳糖代替IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可达细胞总蛋白20~30%，表示量可达总蛋白50%。pET载体3）、构建工程菌目标基因与载体DNA连接重组DNA向宿主细胞内转移筛选与判定带有目标基因阳性克隆影响目标基因表示原因三、重组药品分离纯化◎针对不一样产物表示形式采取不一样策略采取分泌型战略表示重组蛋白，通常体积大、浓度低，所以应在纯化之前采取沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采取包涵体型战略表示重组蛋白，应先离心回收包涵体；采取融合型战略表示重组蛋白，普通是胞内可溶性，拟首先选取亲和层析进行纯化表示在细胞膜和细胞壁之间间隙中蛋白质，应用低浓度溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放重组蛋白。◎针对不一样性质重组蛋白选择不一样层析类型等电点处于极端区域（大于8或小于5）重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这么很轻易除去几乎全部杂蛋白；重组蛋白特异性配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法主要条件，标准是它们与目标蛋白之间解离常数应在适当范围内（10－8～10－4mol/L）;疏水层析和反相层析是依据蛋白质疏水性差异进行分离；凝胶过滤层析是依据蛋白分子量和体积差异进行分离；径向层析是近年来发展起来集层析分离和膜分离于一体一个复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大优越性。◎适当分离纯化介质选择惯用蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose。理想分离纯化介质应含有以下性质：＃对目标蛋白含有较高分辨效率＃对目标蛋白不会造成变性＃化学性能和机械性能稳定，重复性好＃价格低廉◎分离纯化过程规模化蛋白质分离纯化试验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必适当，如：＃试验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）＃试验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）所以，在很多情况下，试验室技术路线不等于生产工艺。四、质量控制确保编码DNA序列正确要了解以下特征：A、目标基因起源、克隆过程、序列B、表示载体名称、结构、遗传特征及酶切图谱、抗生素标识等C、宿主名称、起源、传代历史、检定结果及生物学特征D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态E、插入基因于表示载体两侧控制区核酸序列F、开启和控制克隆基因表示方法及水平种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失现象种子批系统工作细胞库1）、产品判别氨基酸组成份析：肽图分析：N末端和C末端氨基酸测序：蛋白质二硫键分析：重组蛋白相对分子量：等电点测定：2）、纯度分析：SDS-PAGE,CE,IEF,HPLC3）、生物活性测定4）、残余杂质检测宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等5）、安全性检测无菌试验、热原试验、毒性试验、免疫原性检验五、主要重组DNA药品1）、干扰素（IFN-α、β、γ）1957年Isaccs等发觉病毒干扰现象，即病毒感染细胞能产生一个因子，作用于其它细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。依据产生干扰素细胞起源、理化性质和生物活性等差异，可分为α、β、γ等3种，其中IFN-α为多基因产物，有23种以上亚型。1986年，FDA同意Roch企业重组IFN