核酸分离纯化.ppt

核酸的分离纯化主要内容核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。1核酸分离、纯化原则1.2防止核酸的生物降解1.2.1DNA酶抑制剂1.2.2RNA酶（RNAase)抑制剂DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。2）容易降解，保存在4℃或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿，180℃6h。4）剧毒。2.分离提取核酸的主要步骤(3)高速组织捣碎机捣碎(4)超声波处理法2.2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。2.2.1加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；2.2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；2.2.3酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。(1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。2.3核酸的沉淀2.3.1核酸沉淀的盐类及浓度2.3.2有机沉淀剂（2）异丙醇（3）聚乙二醇（PEG）（4）精胺2.3.3核酸沉淀的温度和时间2.4核酸的浓度测定紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤测定结果分析B：测RNA纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。2.4.2溴乙锭荧光法测定核酸的含量(1)对DNA①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20℃中长期保存;③最常用无Rnase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于-70~-80℃。3.1DNA纯化实例（碱裂解法）碱裂解法流程图（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基（三）试剂：溶液I50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II0.2MNaOH1%SDS（新鲜配制）作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。溶液III5MKAC：乙酸钾：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85混合作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：苯酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。异戊醇减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA（DNA）碱裂解法步骤6、上清液移入干净eppendorf管中,加入平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液