核酸的分离纯化.pptx

会计学核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础；
内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。
DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。核酸分离纯化的原则
一、保持核酸一级结构的完整性
二、尽可能提高核酸制品的纯度提取DNA总的原则第一节核酸分离纯化的设计及原则第一节核酸分离纯化的设计及原则一、材料与方法的选择一、材料与方法的选择（一）材料与方法的选择
1、保持核酸碱基序列的完整性

2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度

3、保持核酸的完整性

应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间

尽量避免各种有害因素对核酸的破坏
二、技术路线的设计（一）核酸的释放表５-１各种组织细胞破碎方法核酸分子抽提的技术设计应该清除的杂质主要包括三部分
1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类
物质等
2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子
时，其它的核酸分子皆为杂质
3、加入的有机溶剂和某些金属离子（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定⑴紫外分光光度法：该法是基于核酸分子
中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收
紫外线，其最大吸收波长为260nm。

各种碱基的紫外吸收光谱
⑵荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌
入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激
发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与
溶液中核酸的含量呈正比。
EB与DNA的结合
⑴紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280
的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与
降低均提示不纯。
在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280
纯RNA的A260/A280比值为1.DNA或RNA的定量
OD260相当于
50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA（或RNA）
20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度
DNA纯品:OD260/OD280
RNA纯品:OD260/OD280浓度鉴定
⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电
泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较
RNA大得多，电泳迁移率低。⑴琼脂糖凝胶电泳法：
以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可
判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段
的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果
发生降解，电泳图呈拖尾状。DNA片段的降解完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。

一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降解。若
在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA
的污染。

总RNA电泳图谱（二）核酸的保存1、短期贮存：
4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。
TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PHDNA容易变性。
2、长期贮存：
TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。2、RNA的储存第二节真核基因组DNA的分离纯化生物体组织细胞第二节真核基因组DNA的分离纯化DNA酚抽提法示意图一、酚抽提法DNA样品准备为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？DNA的沉淀DNA的浓缩DNA的检测二、甲酰胺解聚法三、玻棒缠绕法四、其它方法五、DNA片段的纯化六、DNA片段的回收六、DNA片段的回收1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法
2.电泳洗脱法
3.冷冻挤压法
4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法（二）从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。第三节质粒DNA的提取与纯化质粒简介质粒特性常用质粒载体pUC系统质粒DNA的提取和纯化2．细菌的收集与裂解质粒DNA提取方法的选择第三节质粒DNA的提取与纯化一、碱裂解法一、碱裂解法二、煮沸裂解法二、煮沸裂解法三、SDS裂解法三、SDS裂解法四、其它方法四、其它方法四、其它方法五、质粒DNA的纯化EB—CsCl密度梯度离心法简述溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA的原理？五、质粒DNA的纯化第四节真核细胞RNA的分离纯化一、关于RNase酶去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。
必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。变性剂
选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）
使用蛋白酶K
使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠
联合使用RNase的特异抑制剂