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编号:时间:2021年x月x日书山有路勤为径,学海无涯苦作舟页码:第页共NUMPAGES8页第PAGE\*MERGEFORMAT8页共NUMPAGES\*MERGEFORMAT8页大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析张海旺1邓旭明2*张煜1苏杰1胡仲明3(1.河北北方学院,河北张家口,075131;2.中国人民解放军军需大学,吉林长春;130062;3.军事兽医研究所,吉林长春;130062)摘要:目的检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果四环素诱导株产生多重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。关键词:大肠杆菌多重耐药外输泵acrAmarA由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用,各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵(effluxpump)的表达水平提高,能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外,从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌,是发现外输泵最多的细菌,现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB-TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白,可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性,对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析,检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。1材料和方法1.1材料菌株:大肠杆菌质控株ATCC25922,购自吉林省卫生监督检测中心。抗菌药:头孢噻肟、青霉素钾等,均为标准品或对照品,中国药品生物制品检定所出品;盐酸环丙沙星,对照品,中国兽医药品监察所出品。染色试剂:结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。载体与质粒:克隆载体为pGEM-T,Promega公司产品。酶与试剂:T4DNA连接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。其他试剂:乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)、焦碳酸二乙酯(DEPC),Sigma公司产品;dNTP、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷(Tris)等均为TaKaRa公司产品;饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等,均为国产分析纯试剂;DNA片段凝胶回收试剂盒(AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0),TaKaRa公司产品;国家自然基金资助项目,No30270999作者介绍:张海旺,生于1956年,博士,教授。研究方向:耐药机理。*通讯作者E-mail:zhw5148@yahoo.com..cn分子量标准参照物:DNAMarkerDL2,000、λ-HindⅢdigestDNAMarker,均为TaKaRa公司产品。引物:根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物:acrA的上游引物(PACR-F)序列为5´-ATGAACAAAAACAGAGGGTTTACGCCT-3´;下游引物(PACR-R)5´-TTAAGACTTGGACTGTTCAGGCTG-3´,marA的上游引物(PMAR-F)序列为5´-ATGACGATGTCCAGACGCAATAC-3´,下游引物(PMAR-R)5´-CTAGCTGTTGTAATGATTTAATGG-3´。上海博亚生物技术有限公司合成。仪器:生物显微镜,OLYMPUS产品;PCR扩增仪,TC-25/H型,杭州DAHETHERMO-MAGNETICSCO.LTD产品;电泳仪,DYY-6B型,北京市六一仪器厂产品;空气浴振荡器,HZQ-C,哈尔滨市东明医疗