大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析.docx

编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径学海无涯苦作舟页码：大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析张海旺1邓旭明2*张煜1苏杰1胡仲明3（1.河北北方学院河北张家口075131；2.中国人民解放军军需大学吉林长春；130062；3.军事兽医研究所吉林长春；130062）摘要：目的检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果四环素诱导株产生多重耐药氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。关键词：大肠杆菌多重耐药外输泵acrAmarA由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵（effluxpump）的表达水平提高能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌是发现外输泵最多的细菌现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB－TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。1材料和方法1.1材料菌株：大肠杆菌质控株ATCC25922购自吉林省卫生监督检测中心。抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等均为标准品或对照品中国药品生物制品检定所出品；盐酸环丙沙星对照品中国兽医药品监察所出品。染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。载体与质粒：克隆载体为pGEM－TPromega公司产品。酶与试剂：T4DNA连接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC）Sigma公司产品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷（Tris）等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等均为国产分析纯试剂；DNA片段凝胶回收试剂盒（AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0）TaKaRa公司产品；国家自然基金资助项目No30270999作者介绍：张海旺生于1956年博士教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者E-mail：[e-mail]..cn分子量标准参照物：DNAMarkerDL2000、λ－HindⅢdigestDNAMarker均为TaKaRa公司产品。引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列为5´－ATGAACAAAAACAGAGGGTTTACGCCT－3´；下游引物（PACR－R）5´－TTAAGACTTGGACTGTTCAGGCTG－3´marA的上游引物（PMAR－F）序列为5´－ATGACGATGTCCAGACGCAATAC－3´下游引物（PMAR－R）5´－CTAGCTGTTGTAATGATTTAATGG－3´。上海博亚生物技术有限公司合成。仪器：生物显微镜OLYMPUS产品；PCR扩增仪TC－25/H型杭州DAHETHERMO－MAGNETICSCO.LTD产品；电泳仪DYY－6B型北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器HZQ－C哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机TGL－16M长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。1.2.方法1.2.1菌株鉴定对购进的菌株作生化和形态鉴定以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）