环介导等温扩增技术.ppt

环介导等温扩增（LAMP）检测金黄色葡萄球菌摘要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为61℃,只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8～9cfu/mL时仍能检出。LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。简介：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌,在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin—resistantStaphylococcusaureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、PCR法等。环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中,如巴西芽生菌、锥虫病、沙门氏菌、虾中的白斑综合症病毒、志贺氏菌属和大肠杆菌。本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计一套LAMP引物,对金黄色葡萄球菌进行检测,优化反应条件,确定检测特异性,对lamp法与PCR法的灵敏度进行了对比。LAMP的技术原理：材料与方法仪器：2.实验方法②反应条件的优化：分别改变反应温度、Mg2+浓度LAMP扩增,电泳观察扩增产物,确定最适的反应条件。③特异性实验：用建立的LAMP方法扩增大肠杆菌、沙门氏菌等其他18株菌株,电泳观察扩增产物,验证方法的特异性。④灵敏度实验：取过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液,以10倍比进行稀释至10-1～10-9,取各稀释度菌液1mL进行平板计数。同时,取各稀释度菌液1mL,用煮沸法提取DNA,取2μL上清液作为模板进行LAMP扩增。原料乳样品的检测：采用建立的LAMP方法对从农场采的原料乳进行实际检测,同时采用金黄色葡萄球菌国标GB/T4789110-2003对样品进行检测,两种方法进行对比,确定LAMP直接检测乳品中金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度。图2Mg2+浓度对LAMP反应的影响M:DL2000DNAMarker;1:1mmol/L;2:2mmol/L;3:3mmol/L;4:4mmol/L;5:5mmol/L。图5金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果图3与图4金黄色葡萄球菌LAMP与PCR检测的灵敏性实验与PCR检测的灵敏性实验1:10-1;2:10-2;3:10-3;4:10-4;5:10-5;6:10-6;7:10-7;8:10-8;9:10-9。4.对样品的检测结果采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检测出阳性样品81份,GB/T4789.10-2003检测出阳性样品84份,LAMP阳性检出率为96.43%。图5金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果结论谢谢欣赏！后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求感谢您的观看和下载