液相色谱质谱联用技术.pptx

第三章液相色谱—质谱联用的原理及应用液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。液相色谱-质谱联用要解决的重要问题一、LC-MS联用的接口技术2）ESI接口的结构ESI源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统。电喷雾：现在常见的喷嘴是内径为0.1mm的金属毛细管。在它上面施加3～8kV的电压时。由于毛细管的顶端很窄，形成的电场强度可高达106V/m。当流速为0.5～5μL／min的LC流出物溢出金属毛细管顶端时，会形成扇状喷雾。它是细小的液珠和溶剂蒸气的混合体。由于高压电场的作用，溶液中带某种电荷的溶质会向液体表面移动，使液珠表面该种电荷过剩。表面过量电荷的正负，视施加在毛细管电极上的电压正负而定。离子的形成：当表面带有大量电荷的精细液珠向下游移动时，溶剂迅速蒸发，液珠表面积不断缩小，电荷密度增高。当此情况达到Rayleigh极限时，液珠会分裂成更小的液珠。在质量和电荷重新再分配后，更小的液珠进入稳定态；然后再重复蒸发、电荷过剩和液珠分裂。在整个过程的某个阶段，分析物可以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。离子的输送：大气压条件下形成的离子，在电位差的趋使下（当然也有压力差的作用）,通过取样孔（samplingcone）进入质谱真空区。离子流通过一个加热的金属毛细管，进入第一个降压区，在毛细管的出口处形成超声速喷射流。由于分析物带电荷并且动量大，可通过下游处于低电位的锥形分离器的小孔，进入第二降压区，经聚焦后进入质谱。而与分析物离子一同穿过毛细管的少量的溶剂，由于呈电中性而且动量小，则在第一和第二降压区被抽走。电喷雾电离源ESI电喷雾电离源ESI电喷雾接口的主要缺点是它只能接受非常小的液体流量（1～10µL∙min­1）将气动辅助电喷雾技术运用在接口中，使得接口可与大流量（约1mL∙min­1）的HPLC联机使用2.大气压化学电离源（APCI）大气压化学电离是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术，样品溶液从LC流出被气化后，溶剂分子在电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子[M+H]+或[M-H]-，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。APCI是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定。另外，APCI还与高流量的梯度洗脱兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。优点：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3个数量级。大气压化学电离源APCI电喷雾与大气压化学电离的比较二、LC-MS分析条件的选择和优化2.正、负离子模式的选择：3.流动相的选择4.流量和色谱柱的选择5.辅助气体流量和温度的选择六大禁止影响分子量测定的因素6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时会使多电荷离子比例低，多聚体也减少7）样品结构和性质8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好9）样品浓度分子量测定中的误判分子量测定失败的原因目标化合物分析（2）母离子扫描(3)中性丢失扫描三、LC-MS的应用LC-MS应用Mesocarb(双苯斯酮胺)槟榔有效成分的分析1．根据“氮规律”质量数奇数可以得到该化合物含有奇数个N原子。2．结合计算机检索系统，根据同位素丰度，对于荷质比155的分子离子峰可以得到一个环加两个双键的数值。3．由于是正离子电离方式，中性离子丢失不多，且分子离子在首先消去一个中性分子甲基后得到最稳定的140质量数的最高峰。同时根据Beynon表及其最小碎片质量数42的所有可能性可以得到该化合物只能含有不超过两个N原子。（1个）4．对于含有双键和杂环的化合物，它们的分子离子比较稳定，这从谱图和检索系统的碎片质量数上可以得到它们的一些稳定的碎片峰。生物大分子分析多电荷离子ESI在大气压和环境温度下进行，被分析物的分子在电离过程中通常产生多重质子化的离子。下图是典型的ESI质谱图，由一簇不同程度质子化的分子离子峰组成，相邻两峰相差一个质子。对于任意相邻两峰，由下列公式计算所含的质子数(n)和样品的分子量(M)。13＋川牛膝HPLC—MS分析tR=17.67m