重组DNA技术及基因工程药物.pptx

第一节概述第二节基因药物生产的过程第三节目的基因的获得第四节基因表达第五节基因工程菌生长代谢的特点第六节基因工程菌的不稳定性第七节基因工程菌中试第八节重组工程菌的培养第九节高密度发酵第十节基因工程药物的分离纯化第十一节变性蛋白的复性第十二节基因工程药物的质量控制第一节概述基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得基因工程新药的主要蛋白和多肽：①免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体②细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、③激素，如胰岛素、生长素、心纳素④酶类，如尿激酶、超氧化物歧化酶细胞因子构成调节分子中细胞因子组群的主要蛋白/蛋白家族主要基因工程药物简介药品名的商品名人生长激素（hGH)干扰素（IFN)白细胞介素（IL)集落刺激因子（CSF)红细胞生成素（EPO)肿瘤坏死因子（TNF)组织型纤溶酶原激活剂（t-PA)利用基因工程技术生产药品的优点利用基因工程技术生产药品的优点（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源第二节基因工程药物生产的基本过程基因工程基本过程基因工程药物制药的主要程序获得目的基因基因工程药物生产的上游和下游下游阶段在产业化中是极其重要的工程菌（或细胞）构建中重要的工具第三节目的基因的获得CentralDogmaofMolecularBiology中心法则InformationTransferinProkaryotesandEukaryotes第三节目的基因的获得目前克隆真核基因常用的方法有反转录法和化学合成法一、反转录法反转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子一反转录法1mRNA的纯化1mRNA的纯化2cDNA第一链的合成3cDNA第二链的合成4cDNA克隆质粒（Plasmid）是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。大肠杆菌T2噬菌体表达质粒pUC第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入非表达质粒pBR3221、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝噬菌体载体gt10和gt11cDNA文库gt10载体gt11载体cDNA片段与载体的连接cDNA片段与载体的连接CCGAATTCGGGCTTAAGC5将重组体导入宿主细胞（一）转化（transformation）例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取（二）感染（infection）例：λ噬菌体的生活史（三）转染（transfection）上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同