基因工程dna重组技术.pptx

基因工程dna重组技术GeneengineeringTakeadonoregg,suckoutthenucleus,andhencetheDNA,andfuseitwith,say,askincellfromthehumanbeingcopied.Then,withthehelpofanelectricalcurrent,thereconstitutedcellshouldbegingrowingintoageneticduplicate.重组DNA技术重大突破引发当代生物技术兴起，并很快诞生了许多生命科学高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程关键技术，包含了一系列分子生物学操作步骤。基因工程(geneengineering)就是有意识地将一个生物体中有价值目标基因转入另一个生物体中，使后者取得新遗传性状或表示所需要产品。DNA重组技术示意图Onebasiccloningtechniquebeginswiththeinsertionofaforeigngeneintoabacterialplasmid.DNA重组技术第一节质粒和质粒提取Chapter1PlasmidandPlasmidextract（一）关于质粒（1）质粒概念单拷贝质粒（plasmid）（2）质粒复制（3）质粒不相容性(Incompatibility)（4）质粒载体理想克隆载体特征pBR322old-stylegeneralpurposeplasmid以Ampr和Tetr为选择性标识，克隆位点在这两个选择性标识单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr重组子。pUC19MultipleCloningSequence(Polylinker)基因工程dna重组技术（二）提取质粒DNA方法用强热或酸、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)两条链不会分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形整天然超螺旋分子,并溶解于液相中。共价闭环质粒以超螺旋形式存在。提取质粒时，除超螺旋DNA外，还有其它形式质粒DNA。假如质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链张力,形成松驰型环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDNA)；假如质粒DNA两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA)。当质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式泳动速度要比开环和线状分子泳动速度快。所以电泳有2~3条带。附：试剂配制2、LB固体培养基：每升液体培养基中加10-12g琼脂粉,高压灭菌。问题：假如配制1升LB固体培养基，然后分装到10个三角瓶，何时加琼脂粉？3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保留备用。注意分装4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保留于-20℃。问题:溶菌酶作用是什么?5、RNA酶A母液将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml溶液,于100℃加热15分钟,使DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保留于-20℃。6、TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中问题:(1).怎样配制10mmo/LTris·Cl(pH8.0)?(2).TE缓冲液作用?何种溶液能够代替它?7、3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解NaAc·3H2O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。8、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。9、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1％SDS。现用现配10、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。11、酚：市售酚中含有醌等氧化物可引发磷酸二酯键断裂，及造成RNA和DNA交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积0.5mol/LTris·Cl(pH8.0)和0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)