单底物酶促反应.pptx

第四章单底物酶促反应动力学第一节动力学方程推导酶促反应速度的测定与酶的活力单位酶活力测定方法酶活力的表示方法各种因素对酶反应速度的影响底物浓度对酶反应速度的影响单分子酶促反应的米氏方程及Km酶反应速度与底物浓度的关系曲线米氏方程的推导第二节米氏方程的讨论米氏方程所作曲线的曲度，不随Km和Vmax的变化而变化。所以任何酶只要服从米氏方程。则到达任何两个Vmax分数的对应底物浓度之比为一常数。例如：k的物理意义：底物在单位时间转变成产物的量。例如k=0.02min-1，就意味着底物在一分钟内会有2％转变成产物；若k＝2.3min-1＝0.0383sec-1，那就意味着每秒钟有3.83％的底物变成产物。要测定任一时间范围内底物的消耗量或产物的生成量，可用一级速度方程积分。得：第三节实验数据的处理—分析酶促反应速度的作图法1.下图是根据[S]在0.33～2.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图，从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。2.如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax，但由于直线斜率近乎零，-1/Km则难以测得。3.如果[S]比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km和1/Vmax，都难以测准。二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法将米氏方程重排为线性方程：3.Eadie-Scatchard作图法将米氏方程重排为线性方程以上三种作图法也应注意选择底物浓度，不要使[S]比Km高得多或低得多。上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图法应用最广泛。但此法有两个缺点：第一，在v～[S]图上，由相等增值而给出的等距离各点，在双倒数图上变成非等距离的点，且多数点集中在1/v轴附近，而远离1/v轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是主观目测以确定直线最权重的那些点。第二，在测定v时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度下更为敏感，因在高1/[S]值所得的一两个不准确的点，会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择适当的[S]，使1/[S]为等距离增值而得到克服。对第二个缺点关键要注意在低底物浓度下使所测初速度误差尽可能减小。[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图法，v未取倒数。前者对等距离[S]增值所测数据作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。四、米氏方程的积分形式及其对数据的处理米氏方程是一个微分方程，其v=d[P]/dt或v=-d[S]/dt。根据从米氏方程重排得到的线性方程作图求Km和Vmax时，在实验过程中所取数据必须限于初速度阶段，即只能是小于5％的[St]转变为[P]的阶段。但有些情况，例如，产物浓度过低难以测定；或产物根本不能直接测定，而必须测定底物浓度的降低来反映产物的量(即[P]＝[St]-[S])。若只限于5％的底物发生反应就难以测准其降低的量。在这些情况下，如用积分速度方程处理，就不受这种限制。例如，在10％～90％的[St]转变为[P]的数据均可使用。因为积分方程在反应全过程中都是准确的。最简单的积分方程是在假定无产物抑制(即Kms<<Kmp)，并且Keq很大的情况下导出:重排成各种线性形式，如五、Lee和Wilson改良双倒数方程对数据的处理改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为从以上计算可以看出，用改良的双倒数方程作图法处理实验数据时，即使反应已进行到30％，所引入的误差也不过1％左右。很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要，可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆，并使产物抑制成为最小。第四节酶的分析和检测二、酶活力单位和比活力是指酶在一定作用条件下，单位时间内，使底物转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是采用其催化能力来度量；换句话说，是采用酶催化反应的速度来度量，因为在适当的条件下，v∝[E]。为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性，国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。所谓特定条件，温度定为25℃，pH、底物浓度等其它条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位〔IU)。酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。三、酶的转换数转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数(即每微摩