微生物次生代谢产物研究方法.pptx

微生物次生代谢产物的下游研究方法基本流程课程安排一、发酵培养与提取(2)摇瓶培养（实验室规模）适用：细菌、放线菌、真菌（厌氧菌不太适宜摇瓶培养，密封瓶一般体积、重量过大）优点：传质好、溶氧充分，从而生长迅速、周期短缺点：要进行大规模发酵需要大量摇床，占用空间大。(3)发酵罐培养通气发酵罐（好氧细菌、放线菌、真菌）厌氧发酵罐（如啤酒、有机酸、酒精的发酵生产，次生代谢研究？）光生物反应器（光合细菌、微藻）优点：传质效率高、溶氧充分（好氧菌）、温度、pH等参数可控，生长迅速，培养量大缺点：昂贵(4)固态发酵适用：丝状真菌与酵母（如醋、酒酿造，豆豉生产等，酶制剂、维生素、生物毒素、抗生素），现在细菌上也有应用优点：供氧充分，散热及时，条件粗放、成本低，下游处理方便缺点：过程控制、大型化等方面有待改进1.2发酵液的前处理1.2.2前处理目的、原则与流程前处理的一般流程二、分离与纯化系统分离对于经过或未经过生物活性筛选的提取物，在分离纯化过程中不经筛选模型的跟踪指导，分离纯化所有能够得到的纯化合物，并解析结构。最后再根据是否为新化合物及化合物的结构特点，参考相关文献报道或活性预测软件等来进行广泛的生物活性筛选。偏重于传统的天然产物化学研究方法，比较适合冷僻的生物材料和不注重生物活性的研究。优点：不容易漏掉提取物中含有的、能分离到的新化合物，有利于专利申请、文章撰写，也能兼顾各种生物活性。弊端：目的性不明确/有一定盲目性；分离纯化与结构解析的工作量巨大；波谱测试费用比较大基本原则2.1传统的分离方法影响化合物极性的因素：(1)化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。(2)取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。常见基团极性大小顺序如下；酸＞酚＞醇＞胺＞醛＞酮＞酯＞醚＞烯＞烷。举例：判断下列各组化合物极性大小。实例皂甙类：植物粉碎，乙醇提取，分散于水中，依次用低极性的（石油醚、）氯仿、乙酸乙酯萃取除去亲脂性成分（色素、类脂等），以正丁醇萃取富集皂甙类成分生物碱类：水相调pH碱化,使天然存在的生物碱的有机酸盐转化为游离生物碱，有机溶剂萃取；有机相再用酸水萃取使再转化为盐溶于酸水，色素等杂质残留在有机相中；酸水相再不同程度的碱化，以有机溶剂萃取得到碱性强弱不同的总碱组分。成分类型水醇类亲脂性有机溶剂游离生物碱－++生物碱盐++－苷类++－苷元－++挥发油－++糖类（单糖低聚糖）+±－（多糖）＋±－有机酸（大分子）－++（小分子）++－树脂－++氨基酸++－蛋白质、酶±±－鞣质++－色素（亲水性）++－（亲脂性）－++油脂、蜡－++(2)沉淀法(3)重结晶法重结晶方法（达到过饱和方法）1）加热－冷却法（单一溶剂或混合溶剂，对于天然产物不宜过热）选溶剂：取少量产物放人一支试管中，滴人约10倍体积/质量比的溶剂，震荡下观察产物是否溶解，若不加热很快溶解，说明产物在此溶剂中溶解度太大，不适合作此产物重结晶的溶剂;若加热还不溶解，可补加溶剂，当溶剂量大于40倍一产物仍不溶解，则说明此溶剂也不适宜。如所选择的溶剂能在10~40倍体积加热的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较多晶体，说明此溶剂适合作为此产物重结晶的溶剂。方法：热溶饱和再加20％溶剂，(预热漏斗抽滤除杂)，冷却结晶，抽滤，尽量少量溶剂洗涤2）溶剂蒸发法（更常用，单一溶剂或混合溶剂）规律：静大动小，浓快稀慢，快小慢大，快杂慢纯(4)色素脱除传统方法主要用于粗分，可对目标组分进行一定程度的富集；溶剂分配、沉淀、重结晶等方法的合适运用可以大大减少工作中的干扰，降低分离难度、减少工作量；重结晶方法对于单晶制备非常重要，可用于极复杂化合物的结构鉴定。在小试、中试试验中相对更为重要Thanksforyourattention!