RNA干扰完整解析.pptx

RNA的干扰RNA的干扰什么是RNA干扰？RNA干扰的发现RNAi的作用机制RNAi机制目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(invertedrepeats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21~25nt大小的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。核酸内切酶Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。siRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNaseⅢ核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt~23nt的siRNA呢?最近对RNaseⅢ催化结构域的结构的研究使其真相大白。Dicer一种核酸酶,负责将dsRNA转化为siRNA：它属于RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。ModelsforDicercleavage启始阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)(3)效应阶段效应阶段RISCRISCRNA-inducedSilencingComplex(4)扩增阶段RNAi扩大效应目前，对这些现象的解释至少有四种机制：移行RNAi应用：3）肿瘤治疗4）药物开发RNA干扰存在的问题