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基因工程及其应用一基因工程概述二基因工程工具酶三克隆载体四微生物作为克隆载体的宿主五基因工程的常用技术和方法分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程一基因工程育种是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优良性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。基因克隆过程：二基因工程常用的工具酶限制（restriction)与修饰(modification)体系(R/M)：寄主是由两种酶活性配合完成的:一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系的作用：⑴保护自身的DNA不受限制；⑵破坏外源DNA使之迅速降解。1、核酸限制性内切酶的分类I型限制酶的基本特点:反应必须S-腺苷基蛋氨酸、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋，有特异识别位点但没有特异切割位点，切割是随机的。如EcoB和EcoKII型限制酶的基本特点：反应必须ＡＴＰ和Ｍｇ２＋，具有特异性识别部位并切割。如EcoRI、HinfIIIIII型限制酶的基本特点：可以识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24-26bp处切开DNA，切割位点没有特异性。2、限制性核酸内切酶的命名原则第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。形成粘性末端；形成平末端；同尾酶(来源不同，识别靶序列不同但产生相同粘性末端)⑵核酸内切限制酶对DNA的局部消化3、限制性内切酶作用后的断裂方式可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。有一些序列不能被克隆5、影响核酸内切酶活性的因素作用于双链DNA片断，并按3’5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。在低浓度dNTPs的条件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，PolＩ则能够更有效的合成DNA。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.6、如何构建DNA文库？并从中扩增目的基因？第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程（一）cDNA基因克隆根据酶的功能、大小何反应条件及切割DNA的特点，分为三种类型，其中II型酶最常用。0981.c在反应过程中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；粘性未端：切开后的两段DNA各留下一个尾，这2个尾的核苷酸顺序完全一样，方向相反。它们之间是互补的，在适当条件下可以再连接一起。SelICGCGThaICGCGSau3AIGATCCTAGBamHIGGATCCCCTAGG4、限制片断的末端连接作用分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。5、影响核酸内切酶活性的因素⑴DNA的纯度DNase的污染(Mg2+)a.增加核酸内切限制酶的用量b.扩大酶催化反应的体系（稀释）c.延长酶催化反应的保温时间加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。⑵DNA的甲基化程度⑶酶切消化反应的温度大多数酶的标准反应温度37℃。⑷DNA的分子结构某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。⑸核酸内切限制酶标准的缓冲液ａ.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。ｂ.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。ｃ.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。ｄ.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。６、核酸内切限制酶对DNA的消化作用⑴