基因工程工程菌构建.ppt

1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产。因此，利用基因工程技术构建高产菌株备被认为是今后的发展方向。1，3-丙二醇性质1，3-丙二醇用途1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线1，3．丙二醇生物合成途径l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇。一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。（7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。(8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1．5mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000r／min离心2min。(9)取5“L酶切后电泳鉴定。(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。(2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O．3—0．4。(3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却约10分钟。(4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。(5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL，（三）、转化大肠杆菌（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建（五）、酶活力测定（六）、1，3．丙二醇含量的测定二、重组质粒pUC—tac-dhaT的构建及其与pEtac—dhaB—tac-yqhD在大肠杆菌JMl09中共表达实验材料菌种：EcoliJMl09(pEtac-dhaB—tac-yqhD)为本研究“第二章"构建保存的；质粒pUCl9，pEtac由本实验室保藏：dhaT基因从克雷伯氏菌中试剂和工具酶：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒工具酶、抗生素公司、华美生物；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、3PCR引物根据克雷伯氏菌公布的序列，。引物：3PCR引物根据克雷伯氏菌公布的序列，设计片段pEtac．dhaTPCR所需引物：Ps：5’-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3’：P6：5'-ACCCAGAATGCCTGGCG．3’。引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点。实验条件和方法PCR反应体系及反应条件：PCR反应体系：在05mLEppendorf管中按顺序加入以下试剂：10×buffer5m，25mmol／LdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1IIl，模板DNA2pl，脚酶1itl，ddH2032m，总体积50pl。1．3一丙二醇氧化还原酶dhaT的反应条件：94℃预变性5min：变性90s，54℃退火l5min，72℃延伸l5rain，循环35次；72℃保温10min。（1）大肠杆菌基因工程菌的构建将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT连入载体pEtae，以得到的重组质粒pEtac-dhaT。经酶切得到片段tac-dhaT连接到pUCl9上，以得到的重组质粒pUC-tac-dhaT。将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。（2）1，3．丙二醇氧化还原酶的酶活力测定测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活。酶活测定根据250C条件下NAD+还原成NADH的速率来定量。酶活单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物NAD+或生成1“raol产物NADH的酶量。四、重组菌coliJMl09(pEtac—dhaB—tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)发酵培养基优化菌株：重组菌EcoliJMl09(pEtac．dhaB-tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)为本论文三中构建。培养基和培养条件LB培养基(∥L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠lO，琼脂15(固体培养基)，固体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至100}tg／mL、卡那霉素50p．g／mL。种子培