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基因工程菌的构建1、载体多克隆位点 2、缓冲溶液 3、温度 4、末端的性质载体与目的基因的连接连接产物的转化阳性重组子的鉴定constructionofexpressionvector实验操作碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18沉淀加100µl冰预冷溶液Ⅰ,剧烈振荡上清加入450µl饱和酚,混匀500µl70%乙醇洗涤沉淀DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定DNA的酶切与连接连接反应体系 ddH2O8.5μl 10×buffer4.5μl 酶切DNApBR32220μl 酶切DNApUC1810μl T4DNAligase1μl 16℃,15h 取10μl连接产物,核酸电泳(上步剩余酶切产物做对照) 其余连接产物用于转化 重组DNA的转化(二)转化反应 分别加入连接产物20µl,阳性对照质粒pBR3221µl, 阴性对照pUC181µl,空白对照弃500µl上清,连接产物取100µl,10µl各涂一平板, 空白,阳性对照和阴性对照200µl各涂一平板转化子DNA的快速鉴定PCR扩增技术