基础学习实验目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定专家讲座.pptx

目标基因PCR扩增及其扩增产物判定分析此试验共包含以下六个部分第一部分，目标基因选择第二部分，PCR引物设计第三部分，PCR试验操作第四部分，PCR产物电泳判定第五部分，PCR产物测序判定第六部分，目标基因序列变异分析PCR技术创造PCR与临床诊疗基础学习实验目的基因的PCR扩增及其扩增产物的鉴定专家讲座第一部分，目标基因选择NGAL（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin)家族一个组员。NGAL基因蛋白产物含有保护调整基质金属蛋白酶-9活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参加机体铁代谢和天然免疫反应等功效。另外，NGAL作为一个早期标志物还能够帮助判定缺血性肾损伤程度。NGALmRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不一样试验室登记多个版本，包含完整编码区有BC033089和NM_005564等，编码区长为597bp，编码198个氨基酸，包含了N端前部长为20个氨基酸信号肽序列（为核酸序列1-60bp）。NGAL核酸编码区序列及其对应蛋白序列：年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系SHEE和食管癌细胞系SHEEC互为对照，用cDNA微列阵进行筛选，用RNA印迹和RT-PCR进行判定，cDNA克隆测序后与GenBank进行BLAST分析比较。结果表明NGAL基因在SHEEC中出现显著差异过表示，其cDNA序列与小鼠24p3、大鼠NRL(neu-relatedlipocalin)和人中性粒细胞NGAL含有较高相同性。这提醒NGAL基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着主要作用，可能是一个新癌基因或促癌基因。Fascin蛋白mRNA全长为2767bp，由5‘端非翻译区111bp碱基，3’端非翻译区1174bp碱基，1482bp全编码序列区和6个PloyA信号肽组成，编码493个氨基酸，分子量约为55kD。Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)，边缘丝状伪足(filopodia)、微棘(microspikes)关键肌动蛋白束中。以往研究发觉，Fascin基因在许多上皮起源肿瘤细胞系，如宫颈癌Hela、胃癌AGS、大肠癌LM1215和SW480、胰腺癌BxPC3和T3H4等细胞系中均上调表示。细胞丝状伪足和微棘与细胞运动，癌细胞转移有亲密关系，提醒Fascin蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGG