westernblot实验技术和常见问题探讨专家讲座.pptx

westernblot技术westernblot实验技术和常见问题探讨专家讲座WesternBlot介绍WesternBlot技术流程WesternBlot常见问题探讨一WesternBlot介绍蛋白质印迹创造者普通认为是美国斯坦福大学乔治·斯塔克(GeorgeStark)。在尼尔·伯奈特(NealBurnette)于1981年所著《分析生物化学》(AnalyticalBiochemistry)中首次被称为WesternBlot。1.WesternBlot基本原理westernblot实验技术和常见问题探讨专家讲座2.WesternBlot特点3.WesternBlot应用二WesternBlot技术流程1.蛋白样品制备有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多蛋白质可用有机溶剂提取，包含乙醇、丙酮和丁醇等。蛋白样品定量当前惯用比色法测定样品蛋白含量：Lowry法（Folin-酚试剂法）、Bradford法（考马斯亮蓝法）、BCA法等。但各有优缺点，大家能够依据详细情况选取。按对应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。2×SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4百分比混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1百分比与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量普通为20-25μl，总蛋白量20～50μg。2SDS-PAGE解聚后侧链与SDS充分结合形成带负电荷蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷量远远超出了它原有净电荷，从而消除了不一样种蛋白质之间所带净电荷差异。蛋白质电泳迁移率主要决定于亚基相对分子质量，而与其所带电荷性质无关。丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白分离范围灌制分离胶隔绝空气灌制积层胶插入梳子上样过硫酸铵普通现配现用，如连续试验可在4度放置2－3天。配制30％丙烯酰胺储存液要过滤。配制过程中每加入一个试剂要充分混匀，预防胶出现浓度不均情况。要依据温度调整TEMED使用量。水封时候水要慢慢加入，太快会造成胶面不平。插梳子时候要用力均匀，一次成型。在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中杂质。3转膜湿转系统湿转是一个传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一个有效方法但比较慢，需要大致积缓冲液且只能用一个缓冲液。另外用这种方法转移双向电泳中常规使用大胶比较困难。湿转操作步骤：1.起胶：将凝胶从玻璃板中取出，切除积层胶及溴酚蓝下部分离胶，剩下含有目标蛋白分离胶浸泡于转膜缓冲液中，预防胶凝固、变形。2.润湿：准备2张Whatman3#滤纸、1张NC膜，尺寸与凝胶大小相仿（滤纸与胶一样大，膜比胶大一些），NC膜先放入水中3分钟，再放入转膜缓冲液中10分钟。（若用PVDF膜，应先在100%甲醇中浸泡，不然极难润湿。甲醇可重复利用。）3.三明治制作：按次序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡海绵、1层Whatman3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、1层Whatman3#滤纸、海绵，确保每层之间没有气泡。组装次序：转膜夹黑色面（负极）－海绵垫－滤纸－胶－膜－滤纸－海绵垫－红色面（正极）切记：每层之间用滴管/玻棒将其中气泡全部赶出，绝不允许气泡存在！4.转膜：将转移夹放入转移槽，加入4℃预冷转膜缓冲液，将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。转膜电流和时间:普通转膜电流在200mA-400mA之间，转膜时间为30-60分钟。也能够在15-20mA转膜过夜。大片段>50KD能够选取350mA,小片段能够用250mA，上述电流均能很好把大部分蛋白转过去。详细转膜时间要依据目标蛋白大小而定，目标蛋白分子量越大，需要转膜时间越长，目标蛋白分子量越小，需要转膜时间越短。转膜注意事项：胶在负极，膜靠近正极；转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放4℃冰箱；滤纸不要大过膜，预防短路；夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，不然会造成转膜不完全；注意一定要戴手套或用塑料镊子接触膜，因为手上蛋白和油脂会影响转膜效率并会污染膜；在转膜过程中，尤其是高电流快速转膜时，通常会有非常严重发烧现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。半干转移系统半干转移用浸透缓冲液多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快又好（15-45分钟）。多数半干转移方法使用一个以上缓冲系统，能够同时高效转移大小不一样蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。半干转操作步骤与湿转基本类似，区分在于两边都是3层Whatman3#滤纸，转移电压和时间也有所不一样。半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很主要，这么电流必须经过凝胶。不然，在凝胶边缘处滤纸重合将造成电流短路。两种转移系统