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第十章遗传病诊疗与治疗本章内容本章重点第一节基因诊疗概念及应用技术基因诊疗优势和意义:二、基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术基因诊断技术测序基因诊断技术筛查基因突变方法比较检测已知基因突变方法第二节基因诊疗方法及实例DNA分析中惯用遗传性多态性标识:直接基因诊疗及实例直接基因诊疗—突变型遗传病直接基因诊疗B.等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)(Allele-specific-oligonucleotide)斑点杂交结果Southernblot检测结果:Southern-RFLP检测β地贫地中海贫血→珠蛋白基因部分缺失DMD基因诊疗三、间接基因诊疗方法及实例应用条件:遗传标识与易感基因在染色体上连锁遗传标识:基因组DNA多态,如RFLP,VNTR,SNP等连锁分析过程:1、首先确定家系中先证者致病基因与DNA多态等位片段间连锁关系;2、检测家系组员DNA多态性结果;3、分析待检者是否遗传到带有致病基因染色体,间接推断患病情况。Southernblot--RFLP诊疗(PKU)患者为19kb片段纯合子,说明患者缺点PAH基因与19kb片段连锁。其父、母亲缺点PAH基因与19kb片段连锁,其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb和19kb片段杂合子,为表型正常致病基因携带者。成年型多囊肾病诊疗以3´HVR为探针,与PvuII酶切后家系相关组员基因组DNA进行SouthernBlot。12123455.7kb3.4kb2.3kb结果分析间接基因诊疗间接基因诊疗结果分析1)先证者II1含有99bp片段而发病,该片段来自母亲。2)II2有142bp/99bp,为杂合子。142bp来自父亲,为正常片段,99bp片段是来自母亲而成为携带者。3)Ⅲ1为99bp片段;假如是男性为患者(99bp片段来自母亲);假如是女性为携带者(来自父母双方)。PCR-VNTR单核苷酸多态性(SNP)单体型分析21三体产前诊疗进展征FISH分析FISH分析PCR分析荧光定量PCR第三节基因治疗本章重点内容提醒遗传病治疗基因治疗:指应用DNA重组技术,将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或赔偿因基因缺点和异常引发疾病以到达治疗目标。广义上包含直接基因治疗和间接基因治疗。1、直接基因治疗:在原位修复缺点基因,以到达治疗目标。较理想基因治疗策略,难以实现。2、间接基因治疗:以正常基因替换致病基因。Germlinevs.Somaticgenetherapy1、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗基因治疗策略Invivo和Exvivo基因导入A基因添加疗法→添加功效基因,适合用于AR疾病。B直接杀伤细胞→导入自杀基因或原药基因,杀伤疾病细胞。C刺激免疫系统→杀伤疾病细胞。D.靶向抑制基因表示→反义核酸技术,阻断病变基因表示。E.靶向修正突变基因→同源重组法,原位修复缺点基因。自杀基因比如:单纯疱疹病毒哺乳动物细胞HSVGene-TK(在肿瘤细胞中表示,正常细胞中不表示)Gene—TKGCV(胸苷类似物)脱氧胸苷PpGCV---p抑制DNA合成脱氧胸苷酸肿瘤细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡(旁观者效应)反义技术:是指利用人工合成反义RNA或DNA导入靶细胞,阻断基因转录或复制,控制细胞中间阶段使编码蛋白基因不能转录为mRNA或阻断翻译对应蛋白。即利用目标mRNA互补链与之结合从而阻止翻译进行。反义核酸技术基因治疗程序靶细胞选择常见靶细胞目标基因转移方法物理方法——电穿孔法物理方法---显微注射法化学法-----磷酸钙沉淀法:目标基因与磷酸钙等物质混合,形成沉淀DNA微细颗粒,易经过细胞膜进入细胞内,并整合到受体细胞基因组中,在适当条件下得以表示。膜融合-----脂质体法:应用人工制备类似细胞膜膜性结构——脂质体,包装外源基因,再与靶细胞融合,外源DNA导入靶细胞,使其表示。病毒介导基因转移(Viralmediatedtransfer)缺点受体介导基因转移进行基因治疗必须具备以下条件:1、适当疾病:清楚疾病发病机理,基因结构和功效。2、致病基因已克隆,并清楚基因表示与调控机制与条件。3、选择适当受体细胞并在体外有效表示。4、安全有效基因转移方法,以及供研究所用动物模型。人类基因治疗临床应用复合免疫缺点综合征ADA缺乏症基因治疗患者缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)造成致死性疾病。ADA-Gene+vector(逆转录病毒)重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂10天Gene表示回输患儿体内1-2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人25%Exvivo基因添加治疗ADA缺乏症“泡泡女孩”乙型血友病基因治疗黑色素瘤基因治疗利用细胞因子和肿瘤坏死因子基因治疗基因治疗存在问题与伦理学争议本章重点