基因诊疗和基因治疗专家讲座.pptx

第十八章基因诊疗与基因治疗(genediagnosisandtherapy)本章讨论二大方面内容一.基因诊疗概念：利用当代分子生物学和分子遗传学技术方法，直接检测基因结构及其表示水平是否异常，从而对疾病作出诊疗方法。二.基因诊疗特点：针对性强，特异性高检测灵敏度和准确性高实用性强，诊疗范围广三.基因诊疗惯用技术方法（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补特异核酸链形成稳定双链过程。主要依据：碱基互补、变性和复性DNA与DNA杂交：A=T、G≡C;DNA与RNA杂交:A=U、G≡C;变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；复性：随温度逐步恢复，变性两条单链重新形成互补双链hybridization利用核酸双链碱基互补、变性和复性原理，能够用已知碱基序列单链核酸片段作为探针，与待测样本中单链核酸互补配对，以判断有没有互补同源核酸序列存在。核酸探针是指带有标识某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。探针标识物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类。1.核酸分子杂交分类液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应；固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中特异性探针进行杂交反应。惯用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序3.惯用固相核酸杂交方法Southern印迹杂交法（Southernblotting）Northern印迹杂交法（Northernblotting）斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/Slotblothybridization）菌落杂交（colonyhybridization）夹心杂交法（sanwichhybridization）原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）(1)Southern印迹杂交法（Southernblotting）（2）Northern印迹杂交法（Northernblotting）（其基本过程类似于上述Southern法）提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→转移至膜→探针（标识DNA或RNA）与之杂交→显影或显色→检测信号。Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA（3）斑点杂交或狭缝杂交法：基本过程：将变性DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→用标识探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂交信号→分析结果。优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：特异性不高，有一定百分比假阳性。（4）菌落杂交（colonyhybridization）（5）夹心杂交法（sanwichhybridization）（6）原位杂交（nucleicacidhybridizationinsitu）将标识探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，进而检测特异DNA或RNA序列。细胞原位杂交组织切片原位杂交DNA-DNARNA-DNA三类杂交RNA-RNA该法优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞形态，因而更能准确地反应组织细胞功效状态。（二）聚合酶链反应(PCR，polymerasechainreaction)技术（1）DNA模板变性将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后双链DNA发生热变性），并游离于反应体系中作为模板；（2）模板与引物结合（退火或复性）将体系温度降至适当温度（550C左右），使加入引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。（因为加入引物量远多于模板量，所以引物与模板结合百分比远大于模板本身复性）；（3）引物延伸将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补标准连接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，形成两条与模板互补新链。以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸）（新合成链可作为下一轮循环模板）按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA扩增倍数T=2n(n:循环次数)。PCR技术原理示意图2.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板能够是DNA或RNA。以线性DNA模板为佳，量适中，普通为102105个拷贝；RNA作为模板时，需要：RNAcDNAPCR,称此为RT-PCR.（2）耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是从耐热细菌体内提取一个DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而确保PCR在[94℃变性→55℃退火→71℃延伸]循环30次过程中不变性失活。在PCR中，TaqDNA聚合酶应用最广泛。（3）引物引物是依据已知序列模板DNA待扩增区两端而设计一对寡核苷酸小片断，长度普通为1530个碱基。引物是确保PCR扩增产物大小和特异性关键原因，其设计与合成对PCR成功至关主要。引物设