目的基因的克隆与分离鉴定专家讲座.pptx

6目标基因克隆与分离判定基因克隆与基因分离2、基因克隆基因工程或DNA重组技术前提条件是从生物体基因组中分离克隆目标基因。普通来说，目标基因克隆战略分为两大类：第一节目标基因克隆一、鸟枪法(一)鸟枪法克隆目标基因基本战略1.染色体DNA切断2.与载体连接3.转化受体细胞问题(二)鸟枪法操作改进比如，已知某目标基因位于1.8kbSalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离；凝胶DNA片段回收技术凝胶DNA片段回收程序(三)鸟枪法克隆目标基因不足二、cDNA法(一)cDNA法克隆目标基因基本战略2.cDNA第二链合成DNApoldNTPsdCTP3.双链cDNA克隆(二)cDNA法克隆目标基因不足三PCR法由TaqDNA聚合酶扩增PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP含有优先聚合活性。因为该突出碱基存在，克隆时即能够采取TdT末端加同聚尾方法与载体拼接，也能够使用专门T载体克隆。四化学合成法一、化学合成DNA发展三、化学合成DNA（寡核苷酸）应用(一)化学合成法基本战略2.补钉延长法：3.大片段酶促法：化学合成单元操作全基因合成问题第一节目标基因克隆五、基因（组）文库构建(一)基因文库基本概念基因文库构建基本战略1.重组克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作压力；基因文库完备性是指：在构建基因文库中任一基因存在概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间关系可用下式表示：比如，人单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段平均大小为15kb,则构建一个完备性为0.9基因文库最少需要45万个克隆；（二）基因文库构建程序2.基因组DNA切割3.载体和受体选择λ-DNA4.基因文库构建技术性问题第二节基因分离一、基于基因功效基因分离技术1、已知目标基因氨基酸序列（功效克隆）密集铺板（1-10万）依据近缘物种间或进化关系较近物种间功能相关基因间核苷酸序列保守性，设计探针，从基因文库中筛选并判定目标基因。A.cDNA合成B.同源片段克隆Gene1:简并PCR扩增同源片段C.cDNA3'末端序列克隆巢式PCR扩增3'-端cDNA图ZmABC1-10基因全长cDNA克隆D.cDNA5'末端序列克隆1）TaKaRa企业RACE原理2）Clontech企业SMART5'-RACE原理③然后用一个含有部分接头序列通用引物UPM（UniversalPrimer）作为上游引物，用一个基因特异引物（GeneSpecificPrimer，GSP）作为下游引物，PCR扩增目标基因5′末端cDNA片段3）InvitrogenGeneRACER5'-RACE原理CIP②去帽反应：利用烟草焦磷酸酶TobaccoAcidPyrophosphatase（TAP）消化掉mRNA5'末端帽子结构；③接头连接：将经去磷酸化和去帽处理RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，在RNALigase作用下，将RNAOligo接头连接于去帽mRNA5'末端；④反转录：在反转录酶作用下，利用Oligo(dT)反转录取得cDNA;⑥巢式PCR扩增全长cDNA：依据已取得目标基因3‘序列和5’序列，设计基因特异巢式引物5‘GSP和3’GSP，巢式PCR扩增cDNA全长序列。差异杂交Differentialhybridization扣除杂交Substractivehybridization抑制性消减杂交Suppressionsubstractivehybrid差异显示Differentialdisplay基因芯片技术Genechips差异杂交(Differentialhybridization)又叫差异筛选(Differentialscreening)，适合用于分离经特殊处理而被诱发表示mRNA之cDNA克隆。1）差异杂交操作程序2）差异杂交不足不表示目标基因总mRNA差异分离程序3.3抑制性消减杂交(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)总mRNA（B）基因芯片(genechip)激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号二、基于DNA插入作用基因分离技术利用转座子转座作用使被插入目标基因突变失去活性，而转座子删除作用又可使目标基因复活。根癌农杆菌中Ti质粒上T-DNA区可转移入特定宿主细胞中，并整合到基因组DNA上，从而可作为特定标签序列。三、基于基因图谱基因分离技术1、原理：构建遗传分离群体：F2、BC、DH、RIL找到与目标基因紧密连锁分子标识；用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体特定位置；构建含有大插入片段基因组文库(BAC或YAC库)；以与目标基因连锁分子标识为探针筛选基因组文库；用取得阳性克隆构建目标基因区域跨叠群；经过染色体步行、登陆