目的基因的分离和克隆.ppt

第四章目的基因的分离和克隆第一节目的基因的获得一、化学合成法自动化DNA合成仪应用范围：1）合成PCR引物
2）寡核苷酸探针
3）人工接头及较小的基因
二、建立基因组DNA文库2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程）
⑴分离纯化基因组DNA,
提取哺乳动物细胞染色体DNA
⑵制备全部基因组的DNA片断
①机械断裂法
用超声波或高速搅拌DNA溶液
断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用
②限制性内切酶降解（鸟枪法）
过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A
断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。
⑶DNA片断与载体的连接包装
常用载体：粘性质粒λ噬菌体
酵母人工染色体
①基因组DNA+粘性质粒——重组DNA——转化细菌菌落
②基因组DNA+λ噬菌体——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌噬菌斑
1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。基因组文库大小的计算
1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：
In（1－P）
N=———————
In（1－f）
P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。
例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？
In（1－0.99）
N=———————————————=9.2×106
In（1－1.5×103／3×109）若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。四、构建cDNA文库特点：
cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操作更为方便。
mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特定功能基因工作量较小。
mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利于获得较多的模板。（转录特征）
可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同
不能研究基因组的结构功能
构建cDNA文库
1.制备mRNA
1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料
2)从总的RNA中分离mRNA
将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[oligo(dT)]纤维素中进行亲和层析2.第一股cDNA合成
1）以Oligo(dT)为引物：从模板3’末端开始，沿模板的3’→5’方向合成,对于较长的mRNA分子很难得到全长cDNA
2）随机引物：以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链（RNA-DNA）
3.第二股cDNA的合成⑴自身引导法：
⑵置换合成法
⑶外加引物合成法
4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞
(如图4-5)

筛选目的基因
⑴核酸杂交法特殊标记的寡核苷酸链为探针
将扩增好的cDNA文库（即许多带有cDNA重组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）⑵免疫结合法
噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢固地结合在膜上。然后将膜放入含有特异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗去未结合的抗体后，再与125I标记的第二抗体结合,从而找出带有放射性示踪信号的斑点,进而找出对应噬菌斑,克隆扩增,提取DNA后经酶切可获目的基因。获得目的基因的其他方法第二节获得目的基因方法的选择第三节目的基因重组体的构建二、目的基因与载体的连接㈡平端连接法
1.同聚物加尾法
2.用衔接物连接法
3.适配子连接法（带有相应酶切点的粘性末端）
EcoRI粘性末端：5’－AGCGGCCGCG－3’
TCGCCGGCGCTTAA－5’
BamHI／PasI粘性末端：5’－GATCCGG…….CACTGCA－3’
3’－GCC…….GTG－5’
BamHIPasI
4.T－A克隆法
TaqDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时,能不依赖模板而在扩增产物两3’端加上两个游离的“A”。目的基因化学合成法二、聚合酶链反应2.应用：
1）诊断①带有异常外源基因（如病毒）
②变异基因（肿瘤、遗