电镜与样品制备技术支持.doc

电镜与样品制备技术支持电镜样品取材方法1动物及人体组织的取材动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1㎜宽，2～3㎜长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１㎜3的小块，最后用牙签将这些小块逐个放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（０～４℃）。2体外培养细胞的取材生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置３～５min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将具有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2023转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。3植物组织的取材植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。电镜样品取材的基本规定⑴快取材的动作要迅速，最佳在材料离体后１min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。⑵准取材要准确。①器官要准确②部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。⑶冷取材过程应尽量在低温下进行（０～４℃），以减少酶的活性，减少细胞内结构的损失。⑷小所取材料体积要小，一般不超过１㎜3。由于固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。电镜制样中常用固定剂的配制方法⑴缓冲液的配制Ａ、磷酸缓冲液（0.2M）的配制方法如下：甲液：Na2HPO4.12H2O71.64g加蒸馏水溶解成1000ml乙液：NaH2PO4.2H2O31.21g加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液即得所需PH的磷酸缓冲液表1：0.2M的磷酸缓冲液的配制（50ml）PH6.46.66.87.07.27.4甲液（ml）13.318.824.530.536.040.5乙液（ml）36.731.225.519.514.09.5磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。本缓冲液的缺陷是固定期容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。B、二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）甲液：二甲胂酸钠4.28g加蒸馏水至100ml乙液：0.2N盐酸按表2混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液表2：二甲胂酸钠缓冲液的配制PH6.46.66.87.07.27.4甲液（ml）505050505050乙液（ml）18.313.39.36.34.22.7本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反映。缺陷是胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。⑵常用固定液的配制A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）表3：0.1M磷酸缓冲戊二醛的配制戊二醛最终浓度（%）1.01.52.02.53.04.05.00.2M磷酸缓冲液（ml）5050505050505025%戊二醛水溶液（ml）46810121620双蒸水加至（ml）100100100100100100100B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液表4：0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液的配制戊二醛最终浓度（%）1.01.52.02.53.00.2M二甲胂酸钠缓冲液（ml）505050505025%戊二醛水溶液（ml）4681012双蒸水加至（ml）100100100100100C、多聚甲醛-戊二醛固定液取2克多聚甲醛粉末溶于25毫升蒸馏水，65℃下不断搅拌，加1-3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加5毫升5%戊二醛，加二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液（0.2M，pH7.2-7.6）使总体积到50毫升，并加25毫克无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。透射电镜的成像原理目前，主流的透射电镜镜筒是电子枪室和由6～8级成像透镜以及观测室等组成。阴极灯丝在灯丝加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速高压的加速下向下高速运动，通过第一聚光镜和第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再通过物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。电镜总的放大倍数是这四级放大透镜各级放大倍数的乘机，因此透射电镜有着更高的放大范围（200×～1000000×）。透射电镜的一般操作流程接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空，当镜筒真空达成一定规定期，再由扩散泵抽镜筒的高真空，当高真空能达成加高压的规定期，面板上高真空指示灯点亮，表白此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值，稍等一会待