蛋白质一级结构的测定方法专家讲座.pptx

第二节蛋白质一级结构测定一、蛋白质一级结构定义(primarystructure)在每种蛋白质中氨基酸按照一定数目和组成进行排列，并深入折叠成特定空间结构前者我们称为蛋白质一级结构，也叫初级结构或基本结构。关键：蛋白质中共价连接氨基酸残基排列次序,包含二硫键位置。意义：是了解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功效必要基础。蛋白质序列测定基本战略和步骤二、蛋白质一级结构测定方法但伴随Edman液相自动次序分析仪和固相次序分析仪以及气相色谱、质谱(GCMS)等方法相继出现。使结构分析速度也显著加紧。至今已完成近千种蛋白质一级结构分析。当前不但样品用量降低，而且工作人员也大大降低。当年Sanger分析胰岛素用了整整十年时间，今天利用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右蛋白质只需要几天，可见新技术应用和发展对科学发展起促进作用，蛋白质一级结构测定方法综述及专著文件较多。三测定前准备工作及测定普通步骤蛋白质分子一级结构测定，概括起来包含多肽链分离、降解、肽段分离和次序分析以及－S－S－定位等。一级结构测定方法①过甲酸氧化②巯基乙醇还原③Cleland‘s试剂还原作用稳定SH基方法：稳定SH基方法：（B）氨乙基化2）末端分析（1）N-末端测定B.氰酸盐法异硫氰酸苯酯（PTC或PITC）与N末端α－氨基发生反应，生成PTC－钛,在弱酸中自发环化转变成PTH－衍生物。该试剂称为Edman试剂。因为PTH－衍生物从多肽链上脱落下来对其余部分没有影响，所以惯用来测定蛋白质一级结构。（1）N-末端测定C.二甲基氨基萘磺酰氯法氨肽酶法2）末端分析（2）C-末端分析（2）C-末端分析B.羧肽酶水解法羧肽酶法测C末端C-末端分析C.C-端氨基酸选择性氚标识法：使用氚标识是测定C-端氨基酸最好方法，专一性强，灵敏度高，不过这种方法不能用于C-端脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）酸水解碱水解氨基酸分离和含量测定层析氨基酸分离②氨基酸自动分析仪就是利用离子交换方法氨基酸自动分析仪就是利用离子交换方法若要测定某蛋白质样品氨基酸组成，事先把样品经酸水解，调整水解液pH为3，使全部氨基酸都带负电荷，因为各种氨基酸侧链基团复杂性，各种氨基酸所带电荷强度差异比较大，pH3时,对于酸性氨基酸来说即使也带正电荷，但因为谷氨酸γ-羧基和天冬氨酸β-羧基，都有不一样程度离解，造成整个分子偏中性，对于碱性氨基酸来说，原来结合质子能力就很强，此时，它所带正点荷强度就更大。酸水解破坏了色氨酸、使谷酰胺和天冬酰胺转变为对应谷氨酸和天冬氨酸。为了分离效果好，在洗脱过程中，使用不一样pH和离子强度洗脱液。经氨基酸自动分析仪洗脱下来氨基酸，按次序进行染色，由统计仪自动描绘出各种氨基酸光吸收图谱。3）氨基酸组成份析各种氨基酸侧链基团性质对于氨基酸与离子交换树脂，结合情况有相当复杂影响。在氨基酸自动分析仪统计上能够看出：天冬氨酸（pI为2.98）最先随洗脱液下来，赖氨酸（pI为9.74）最终下来，三个中性氨基酸如:甘氨酸（pI为5.97）、苏氨酸（pI为6.53）和亮氨酸（pI为5.98）洗脱次序又怎样呢?苏氨酸应该带有较多正电荷，与树脂结合比较紧，不易被洗脱下来，不过因为羟基含有极性，减弱了树脂对氨基酸吸引力。所以反而比甘氨酸和亮氨酸后被洗脱下来。甘氨酸和亮氨酸相比，亮氨酸侧链疏水性强，与树脂结合紧，后甘氨酸被洗脱下来。总而言之：影响离子交换树脂分离氨基酸原因：（1）氨基酸分子所带电荷；（2）氨基酸分子极性；（3）氨基酸分子形状和大小。3特殊氨基酸测定羟基：Ser（丝氨酸），Thr（苏氨酸），—OH特征：在普通条件下，丝氨酸和苏氨酸分子中羟基都不解离。反应：①与酸作用生成酯，如丝氨酸磷酯，蛋白质磷酸化绝大多数都发生在丝氨酸残基上。②许各种酰化剂能够与酶活性中心丝氨酸羟基作用，造成酶失活。③酪氨酸酚基可与Folin反应基础，可作为蛋白质定量。为Millon反应基础。咪唑基：His（组氨酸）,特征：在生理条件（pH7）下，组氨酸咪唑基含有缓冲作用。这是因为咪唑基一侧去质子化和另一侧质子化作用同时进行。pH6时，50％质子化，pH7时，90％去质子化。也就是说，在生理条件（pH7）下，组氨酸咪唑基既能够作为质子受体，也能够作为质子供体。所以组氨酸在酶催化作用中，起非常主要作用。反应：Pauly反应（对氨基苯磺酸重氮盐，红色产物）甲硫基：Met（甲硫氨酸）,－S－CH3特征：甲硫氨基酸侧链上甲硫基是一个强亲核中心，轻易与卤代烷发生亲核反应，生成烷基化产物。该种产物用巯基试剂处理能够除去烷基和原有甲基，所以与带有14C标识碘甲烷反应，再用巯基试剂处理能够得到含有同位素14C标识甲硫氨酸。2.多肽链降解溴化氢化学降解法其优点：1）化学法②羟胺法1）化学法（2）部分酸水解法优点：专一性高，降解