电泳技术医学知识专家讲座.pptx

第三节电泳技术electrophoresistechnology第一节概述一、电泳技术概念二、电泳技术分类三、电泳技术特点第二节电泳技术基本原理一、电泳迁移率表2-1血清蛋白等电点与电泳迁移率二、影响电泳迁移率原因1．缓冲液化学组成（缓冲溶质）缓冲体系组成常选取弱酸/弱酸盐、酸式盐/次级盐。对缓冲液要求是化学性质稳定、电导率低、缓冲容量大、粒子移动性好。按此要求，缓冲液pH值确定后，第一，选择缓冲液时要尽可能选择pKa靠近缓冲液pH弱酸成份，此时缓冲容量最大。第二，优先选取离子价数为1价电解质，目标是保持离子活度。第三，优先选择正、负离子移动速度相近电解质，使电泳时离子分布均匀，确保电泳区带整齐。2．pH值溶液pH值决定了带电颗粒解离程度，也决定了物质所带净电荷多少。如缓冲溶液pH值大于待分离蛋白质等电点pI，则蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动。当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个能扩大各种蛋白质所带电荷量差异pH值，以利于各种蛋白质分离，当然不能过酸过碱，以免引发蛋白质变性。缓冲液pH值普通设在4.5～9.0为宜。例：求0.015MNa2SO4溶液离子强度：I=（0.015×2×12+0.015×22）/2=0.045（mol/L）缓冲液离子强度影响缓冲容量、产热效应和电泳速度。离子强度大，缓冲容量大，pH值稳定；但离子强度大，电泳速度慢；同时离子强度大，电流强度大，产热多，蒸发快。速度慢，会造成时间过长，标本扩散。速度快，造成区带不整齐，分辨率低。综合考虑，离子强度最好选在0.02～0.2mol/L之间。（四）支持介质支持介质对电泳影响主要表现为电渗作用和吸附作用。1．电渗作用液体在电场中对于一个固体支持物相对移动，称为电渗作用。在电泳时应尽可能防止使用含有高电渗作用支持物。2．吸附作用支持介质表面对被分离物质含有一定吸附作用，使被分离样品滞留而降低电泳速度，造成样品拖尾，使电泳分辨率降低。电泳时，要选择吸附作用小支持介质。第三节电泳仪一、电源二、电泳槽第四节几个惯用电泳技术一、醋酸纤维素薄膜电泳（一）优点（二）缺点【试验名称】醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质【试验原理】血浆中各种蛋白质等电点不一样，普通都低于pH7.4。它们在pH8.6缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。因为血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带电荷量不一样，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳速度也不一样。所以能够将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，纤维蛋白原６条区带。（三）操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤血清蛋白电泳（五）应用二、琼脂糖凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳优点（二）聚丙烯酰胺凝胶聚合（三）聚丙烯酰胺凝胶孔径和机械强度调整（四）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳表2-2血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳条件（五）操作步骤四、等电聚焦电泳（了解）五、双向电泳双向凝胶电泳仪