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流式细胞术(仪)流式细胞仪--FACSAria流式细胞仪—历史回顾流式细胞仪/术—定义是细胞或颗粒在液流中成有序队列经过激光术过程。检测基于细胞或颗粒光学散射特点和荧光信号差异。是单细胞水平上细胞或颗粒物理与化学特征分析。流式细胞仪—系统组成流式细胞仪—液流系统流式细胞仪—光学系统FSC细胞或颗粒体积成正比正圆形细胞或颗粒表面积成正比滤光片/双色性滤光片长通短通带通流式细胞仪—电子系统流式细胞仪—软件系统流式细胞仪—研究对象流式细胞仪—染色荧光一抗一抗+荧光二抗直接染抗原染料(PI、EB)流式细胞仪—对照阴性对照流式细胞仪—荧光赔偿(单管单标识)例:一个样本只有FITC染色PE不染色,检测FITC和PE检测器都开着。单管双标识流式细胞仪—分选流式细胞术应用细胞调亡检测细胞会缩水变小,细胞内部颗粒会变多细胞质膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻造成细胞膜不对称性消失蛋白水解酶——Caspase酶活化核酸内切酶活化造成DNA断裂线粒体膜电位改变细胞质膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻造成细胞膜不对称性消失核酸内切酶活化造成DNA断裂细胞调亡检测—caspase酶活化细胞调亡检测—caspase酶活化核酸内切酶活化造成DNA断裂线粒体膜电位改变液相蛋白芯片技术-BDCBAFlexset样本制备好坏与流式细胞仪结果?固体组织机械性解联基本程序新鲜组织→组织分散→原始悬液→过滤→离心→洗涤→细胞悬液细胞计数和活性检测→细胞固定注意事项在4℃培养液中处理细胞和保留固体组织酶消化性解联几个关键点消化酶组成:2.5mg/ml胰蛋白酶,0.5mg/ml胶原酶II和20μg/mlDNA酶I组织消化条件37℃,1h,温和振荡培养细胞细胞悬液制备钙螯和法5mMEDTA30min优点:细胞表面抗原保留完好缺点:耗时,低回收率,减低细胞存活率酶消化法胰酶/EDTA(0.02-1%/5mM),1-10min优点:快速,高回收率,高细胞存活率缺点:可能显著改变细胞表面抗原表示血液标本抗凝剂选择染色前样本储存时间标准越短越好保留温度4℃或RT适当储存方式取决于细胞种类,分析类型和样本处理方法即时各种细胞功效检测,髓系细胞免疫表型≤1h,4℃单核细胞表面抗原分析<2h,4℃嗜酸性粒细胞表面抗原分析≤72h,淋巴细胞免疫表型与DNA倍数分析样本制备过程中,防止温度重复升降尤其是测细胞功效时候荧光抗体要进行分装使用前要15000g离心除去聚集体Fc受体阻断策略用非特异性抗体进行前孵育目标抗体染色时,加入超饱和非特异性抗体荧光素选择荧光素明亮度(和分子量大小相关)PE>PE-Cy5>PE-TexasRed>APC>FITC选择最明亮荧光素标识低密度抗原选择FITC标识细胞核抗体样本染色后洗涤还是不洗涤?取决于以下得失平衡洗涤:洗涤过程中会引发假象?不洗涤:增加背景染色?洗涤是必要步骤检测细胞表面抗体结合悬浮介质含大量可溶性抗原HO染色标本不适合在FACSAria上检测因为该型号机子上没有352nm激发光Thankyouforyourlistening!