肝细胞原代培养实验方案.doc

原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来,国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究,但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。初期重要用非酶法分离肝细胞,涉及机械法(如匀浆法)及螯合法。机械法对肝细胞损伤大,细胞活率低;螯合法是用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂(如枸橼酸盐或EDTA)分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞,涉及胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间规定十分严格,且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶,对肝细胞膜破坏严重,因而易导致肝细胞死亡,导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小,虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害,但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触克制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体,使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用,有助于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此,要获取抱负的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。Seglen二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改善。作者认为,采用胶原酶消化法,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高,作用时间难以控制;浓度过低,则作用时间过长、细胞活率减少。事先用无Ca2+、Mg2+的灌注液进行预灌注,去除Ca2+依赖性粘附因子,使桥粒断裂;然后用含Ca2+的胶原酶消化,胶原酶的作用需要Ca2+的活化,在5mmol/LCa2+浓度下,用浓度为500mg/L的胶原酶37℃条件下消化15min最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时,温度需保持在0～4℃。肝细胞分离时,pH值宜维持在7.4左右,不低于7.2,最高不超过7.6,否则将对肝细胞导致很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压,提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。培养板预解决及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较,发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用Sigma公司提供的胶原铺胶,置于37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含8%胎牛血清的WE作培养基,效果不错,但WE价格昂贵,我们试着采用含10%胎牛血清的RPM1640培养基,并在其中加入胰岛素,地塞米松等生长因子,肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响:密度太小,细胞不易生长;密度太大,肝细胞增殖受到克制,培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为5×105/ml左右时,试剂及仪器重要试剂:胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国Sigma公司。鼠尾胶为自行配制。WilliamsE培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司。BT01-100蠕动泵(保定格兰蠕动泵有限公司)、Sorvall低温离心机(美国Kendro公司),CL-800全自动生化分化仪(日本岛津),XD-101倒置显微镜(南京光学显微镜公司)。HeraeusCO2孵箱(美国Kendro公司),KT-902洁净室(无锡康达净化空调设备厂)。实验环节：一、原代大鼠肝细胞的分离1.实验动物Spragure-Dawley（SD）大鼠购自泸州医学院实验动物中心。雄性，清洁级，体重150～200g，8～12周龄。分笼饲养，喂饲标准的大鼠饲料，随意饮水，保持室温20℃～25℃。2.重要仪器设备:倒置相差显微镜（）；自动平衡微型离心机：LDZ4-0.8北京医用离心机厂；套管针（）；超净工作台（）；电子分析天平（）；外科手术器械（）3.重要试剂及药品：Ⅳ型胶原酶（）；RPMI1640培养基（）；胎牛血清（）；台盼蓝（）；Percoll分离液（）；PBS缓冲液（）；青霉素（80万U）及链霉素（100万U）（）胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松4.具体实验环节：SD大鼠，氯胺酮80mg/kg腹腔内麻醉．同时腹腔内注射1000U肝素钠注射液抗凝．固定大鼠仰卧位于超净工作台上（用前紫外灯照射超净台半小时），剪去胸腹部体毛，碘伏胸腹部皮肤消毒后，带无菌手套，铺洞巾，取腹部正中切口，可见鲜红的肝脏，暴露出门静脉和肝下下腔静脉，用弯头钳子钝性分离门静脉和下腔静脉，并在各静脉下放置1根4零细线，暂不结扎，用套管针以约15°角在门静脉远端向近端平行刺入（注意针头刺入在距离门静脉3个分支处0.5cm，刺入过深势必影响灌注效果）．细线结扎后以封闭门静脉远端，再退出金属针心，并将套管针连接一次