一种检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103383354A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103383354103383354A(43)申请公布日2013.11.06(21)申请号201210134276.X(22)申请日2012.05.03(71)申请人北京博迈世纪生物技术有限公司地址100070北京市丰台区科兴路7号505室(72)发明人陈海生张华英(51)Int.Cl.G01N21/76(2006.01)G01N33/577(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书5页说明书5页(54)发明名称一种检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法(57)摘要一种检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法，属于食品安全检测技术领域。提供了一种从食品、制剂中快速检测肠毒素SEA（金黄色葡萄球菌肠毒素A）的磁微粒化学发光方法。其工艺步骤为：标准品稀释后加入标记物，混匀，温浴，沉淀，清洗，加入发光底物，测定化学发光强度，绘制标准曲线，被测样品的OD值在标准曲线之间。优点在于：操作简便，快速，灵敏度高，特异性强，费用低廉。CN103383354ACN103854ACN103383354A权利要求书1/1页1.磁微粒化学发光免疫试剂盒检测肠毒素SEA的方法步骤为：将标准品稀释成25ng/ml、10ng/ml、3ng/ml、0.9ng/ml、0.3ng/ml，0ng/ml加入反应管中，每孔10-100ul；向反应管中分别加入鼠抗SEA单克隆-FITC标记物10-100ul。2.向反应管中分别加入鼠抗SEA单克隆-ALP标记物10-100ul。3.充分混匀，37℃温浴5-20min。4.将上述反应管放在磁分离架上沉降1-2min，用100-500ul洗液进行清洗。5.重复步骤5，1-3次。6.向反应管中加入碱性磷酸酶化学发光底物50-300ul，在化学发光仪上测定化学发光强度以各点发光强度值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘出标准曲线，从上面找到被测样品的浓度，被测样品稀释后的OD值应在标准曲线之间。7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标准品为SEA标准品溶液。8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记物为鼠抗SEA单克隆抗体-FITC和鼠抗SEA单克隆抗体-ALP。9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的底物为碱性磷酸酶化学发光底物。2CN103383354A说明书1/5页一种检测肠毒素SEA的磁微粒化学发光试剂盒及其检测方法技术领域[0001]本发明属于食品安全检测技术领域，提供了一种从食品、制剂中快速检测肠毒素SEA（金黄色葡萄球菌肠毒素A）的磁微粒化学发光的方法，本方法中采用双单克隆抗体夹心法组建磁微粒化学发光试剂盒，该方法与传统的方法比较具有适用领域宽广、用时短、特异性强、灵敏度高等特点，对食品及其他领域的应用具有十分重要的意义及实际应用价值。背景技术[0002]本发明涉及针对SEA专一性磁微粒化学发光免疫试剂盒，双单克隆抗体夹心法检测食品中葡萄球菌肠毒素SEA，其灵敏度为0.014ng/ml，检出速度快，0.5h就可出结果，鼠抗FITC单克隆抗体磁性微球试剂运用到本试剂盒当中，与多抗试剂比较增加了以下特点：1.特异性好；2.重复性高；3.高灵敏度等特点，降低了样品中的物质的干扰，提高了产品的检出率，同时增加了试剂盒的稳定性。[0003]金黄色葡萄球菌是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多，占45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。食品受其污染后，不仅腐烂变质，而且部分菌株产生肠毒素，在每100g食物中含有不足18ug的肠毒素便能引起金黄色葡萄球菌食物中毒症状，目前已经确认的肠毒素至少有A、B、C(包括Cl、C2、C3)、D、E和F等六个型，其中多数食物中毒是由SEA引起的。因此对肠毒素SEA的检测是食品安全检测的一个重要指标。[0004]目前食品卫生的检验中主要用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，通常采用的方法有免疫琼脂扩散法、反向间接血凝试验、免疫荧光法和酶联免疫吸咐法。早期采用动物学试验的方法检测动物学试验因结果判断直观、准确，在某些情况下可采用，但由于试验动物来源困难、灵敏度低、检测结果不够理想等使其应用受到极大的限制，并且不能精确检测出SE的不同类型。而免疫琼脂扩散法虽然特异性强、准确度高、操作简单、不需仪器设备，但其灵敏度低，检查可疑食品中低浓度肠毒素时，必须将毒素浸出后浓缩，有时甚至要提纯，实验时间约需要3-5天，不能快速检测出结果。凝集试验步骤繁琐，特异性、敏感性相对较低；用于SE检测的免疫