Ⅲ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号(10)授权公告号CNCN102998462102998462B(45)授权公告日2014.12.10(21)申请号201210473594.9(22)申请日2012.11.20(73)专利权人博奥赛斯（天津）生物科技有限公司地址300300天津市东丽区开发区四纬路10号(72)发明人刘萍范利花(74)专利代理机构天津滨海科纬知识产权代理有限公司12211代理人李莉华(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/531(2006.01)审查员周露露权权利要求书2页利要求书2页说明书9页说明书9页附图1页附图1页(54)发明名称Ⅲ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种PCⅢ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，所述试剂盒包括：PCⅢ校准品，PCⅢ校准品浓度为0，20，50，100，200，500ng/mL，校准品稀释液为含有5%牛血清的生理盐水溶液；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的PCⅢ抗体；PCⅢ抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；PCⅢ质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。另外本发明还公开了本发明试剂盒的制备方法。本发明试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，安全无环境污染。此外，本发明还具有检测样品的浓度范围宽、成本低、稳定性好等优点。CN102998462BCN1029846BCN102998462B权利要求书1/2页1.PCⅢ型前胶原磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)PCⅢ校准品；PCⅢ校准品浓度为0，20，50，100，200，500ng/mL梯度浓度，校准品稀释液为含有5％牛血清的生理盐水溶液；2)偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2μm；3)生物素标记的PCⅢ抗体；4)PCⅢ抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；5)PCⅢ质控品，所述质控品包括低值质控品和高值质控品，浓度分别是42.5ng/mL和255ng/mL；6)化学发光液A液和B液，发光液A液主要成分为0.7g/L鲁米诺，B液主要成分为0.675g/L过氧化脲；7)20倍浓缩洗液；8)反应管，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。2.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)PCⅢ校准品的配制：将PCⅢ纯品用含有5％牛血清的生理盐水溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0，20，50，100，200，500ng/mL；(2)PCⅢ质控品的配制：将PCⅢ纯品用含有50％牛血清的生理盐水溶液分别稀释至低值质控品42.5ng/mL，高值质控品255ng/mL；(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：取100mL0.1mol/L2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5μL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL0.01mol/LPBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/LPBS定溶至1L即可；(4)生物素标记的PCⅢ抗体的制备取0.5mgPCⅢ抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25μg生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10％，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250μL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/LPBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；(5)PCⅢ抗体酶结合物的制备采用高碘酸钠氧化法将PCⅢ抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至1:8000，并加入5-20％酶稳定剂，储存于2～8℃；(6)20倍浓缩洗液的配制20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/LNaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；2CN102998462B权利要求书2/2页(7)化学发光液A液和B液的配制A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/LTris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；(8)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；(9)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。3CN102998462B说明书1/9页Ⅲ