具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103509182103509182A(43)申请公布日2014.01.15(21)申请号201210206856.5(22)申请日2012.06.21(71)申请人中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所地址215123江苏省苏州市工业园区若水路398号(72)发明人张智军刘敏沈贺(74)专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103代理人范晴(51)Int.Cl.C08G73/04(2006.01)C12N15/87(2006.01)A61K48/00(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书6页说明书6页附图4页附图4页(54)发明名称具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法(57)摘要本发明所要解决的问题在于提供一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法：通过迈克尔加成的方法，一步制备聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子基因载体。本发明的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体通过静电相互作用与带负电荷的DNA分子形成聚电解质复合物，复合物中的阳离子聚合物一方面包裹DNA使之不被核酸酶降解；另一方面其“质子海绵作用”可有效帮助复合物实现内涵体逃逸，释放的DNA进入细胞核表达相关蛋白质，实现基因治疗。CN103509182ACN1035982ACN103509182A权利要求书1/1页1.具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体制备方法，其特征在于，包括以下步骤，（1）取聚乙烯亚胺溶于无水甲醇，加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺,聚乙烯亚胺：N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为4：0.77，通往氩气保护，反应过夜；（2）将反应液置于RC膜透析袋中，其截留分子量为3500，超纯水透析5-8天，冻干得到黄色油状固体，即为制备的聚乙烯亚胺-亚甲基双丙烯酰胺聚阳离子高分子，保存在干燥器中，反应式如下。2.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为423Da-1800Da。3.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为800Da。4.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应温度为25-100°C5.根据权利要求1所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应温度为50℃。6.一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体，其化学式I为7.如权利要求6所述的具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体用于基因治疗。2CN103509182A说明书1/6页具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及基因治疗技术领域,特别涉及一种具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺阳离子高分子的基因载体及其制备方法,阳离子高分子与DNA结合后，有效实现内涵体逃逸，递送DNA进入细胞表达相关蛋白质，实现基因治疗。背景技术[0002]随着基因治疗研究的不断深入，尤其是基因治疗临床实验的广泛开展，人们越来越认识到选择恰当的载体，使目的基因靶向、可控并有效地表达，是基因治疗成功的关键。目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体（viralvector）和非病毒载体（non-viralvector）两种。病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，转染效率高且对大多数细胞都有靶向作用，已被广泛而有效地得到了应用。但是其携带的DNA大小有限，而且病毒载体能引起免疫原性反应、致癌性以及能任意地整合到主体的基因组当中，存在着很大的安全隐患。而非病毒载体具有合成简单、可以携带大容量的遗传物质、无免疫原性等诸多优点，因此非病毒载体的研究倍受人们的重视（MintzerMA,SimanekEE.Chem.Rev.2009,109,259-302;MorilleM,PassiraniC,VonarbourgA,ClavreulA,BenoitJP.Biomaterials.2008,29,3477-3496）。[0003]到目前为止，研究者们已设计了多种类型且各有特点的非病毒基因载体，其中，阳离子高分子由于具有安全性高，免疫原性低，易于对DNA进行操作，价格低，特别是其结构易于改造等优点，因此人们对阳离子聚合物作为基因载体的兴趣越来越高，基于阳离子聚合物载体的基因传递方式已经被广泛应用于人类遗传病和其他疾病的基因治疗研究。虽然这些阳离子载体具有极低的免疫原性，但是较低的转染效率和瞬时蛋白表达成为这类载体用于基因治疗中的最大障碍。因此如何提高阳离子聚合物基因传递体系的基因转染效率