基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103509183103509183A(43)申请公布日2014.01.15(21)申请号201210206915.9(22)申请日2012.06.21(71)申请人中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所地址215123江苏省苏州市工业园区若水路398号(72)发明人张智军刘敏沈贺(74)专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103代理人范晴(51)Int.Cl.C08G73/04(2006.01)A61K48/00(2006.01)A61K47/34(2006.01)权权利要求书1页利要求书1页说明书6页说明书6页附图5页附图5页(54)发明名称基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体及其制备方法(57)摘要本发明所要解决的问题在于提供一种基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体及其制备方法：通过迈克尔加成的方法，一步制备基于聚乙烯亚胺的可降解阳离子高分子基因载体。该基因载体利用静电相互作用与带负电荷的DNA分子形成聚电解质复合物保护DNA片段不被核酸酶降解；该基因载体同时具备可降解性质，降解产物失去与DNA结合的能力，从而达到高效释放DNA的目的，最后，释放的DNA进入细胞核表达相关蛋白质，实现基因治疗。CN103509183ACN103598ACN103509183A权利要求书1/1页1.基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，（1）溶于无水甲醇的聚乙烯亚胺中以质量比4:1加入1，4-丁二醇双丙烯酰胺，通往氩气保护，反应过夜；（2）将反应液置于RC膜透析袋中，其截留分子量为3500，甲醇透析，最后旋干甲醇溶液，冰水溶解，冻干得到油状物，即为制备的基于聚乙烯亚胺的可降解基因载体，保存在-20℃，反应式如下。2.根据权利要求1所述的基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为423Da-1800Da。3.根据权利要求1所述的基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺分子量为800Da。4.根据权利要求1所述的基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应温度为25-100°C。5.根据权利要求1所述的基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中反应温度为50℃。6.一种基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体，如下化学式I：其中，X为6-210；Y为6-210。7.如权利要求6所述的基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体用于基因治疗。2CN103509183A说明书1/6页基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体及其制备方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及基因治疗技术领域,特别涉及一种基于聚乙烯亚胺的可降解阳离子高分子基因载体及其制备方法,即可降解阳离子通过静电相互作用与DNA形成复合物，递送DNA进入细胞并且表达相关蛋白质，从而实现基因治疗。背景技术[0002]基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。通过基因治疗的方法可以治疗多种严重疾病，包括：遗传病（如囊性纤维病等）、心血管疾病、恶性肿瘤、白血病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择，当前，基因传递载体主要可分为两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有较高的转染效率，但是由于病毒载体携带基因长度有限、安全性不高、价格昂贵等限制了其临床应用。非病毒载体安全、易于制备。而研究最多、应用最广泛的非病毒载体是阳离子高分子载体（LiS,HuangL.GeneTher.2000,7,31-34;MintzerMA,SimanekEE.Chem.Rev.2009,109,259-302）。[0003]带正电的阳离子高分子/DNA复合物与带负电的细胞膜通过静电作用相互结合以后，细胞通过胞吞摄取高分子/DNA复合物。胞吞是一个复杂的过程，包括结合、内在化、形成内体、溶酶体融合及裂解等。内体中的酸性环境（pH5.5）以及可以降解DNA的酶都会导致复合物和DNA的降解，因此为了避免降解，复合物必须迅速从内体中逃逸出来，这个过程称之为内体逃逸（endosomeescape）。DNA或复合物从内体中逃逸进入细胞质，在细胞质中扩散到细胞核的膜上，通过细胞核膜上的核孔或在核定位信号多肽（nuclearlocalizationsignalpeptides）的帮助下通过核膜受体进入细胞核并表达相应的蛋白质。近十多年来，各种天然和合成的阳离子高分子用作基因传递系统，包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚酰胺-胺树形高分子（dendrimer）、脱乙酰壳多糖（ch