EGFR基因突变检测用组合物及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110541033A(43)申请公布日2019.12.06(21)申请号201910925527.8(22)申请日2019.09.27(71)申请人迈克生物股份有限公司地址611731四川省成都市高新区百川路16号(72)发明人赵雨航王书芳葛志琪何辉煌李锦(51)Int.Cl.C12Q1/6886(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书2页说明书23页序列表4页附图2页(54)发明名称EGFR基因突变检测用组合物及检测方法(57)摘要本发明公开一种高灵敏度的EGFR基因突变的检测用引物组合物及其检测方法。该引物组合物包括两条上游引物、探针和下游引物，其中第一条上游引物仅部分与靶序列互补配对，第二条上游引物及探针的序列分别与第一条上游引物上未与靶序列互补配对的部分序列相同。本发明的检测方法采用了数字PCR的方法，在进行常规数字PCR反应前对样本进行解链成单链的预处理。利用本发明的引物组合物及检测方法，可提高EGFR基因突变的检测灵敏度、特异性、降低检测成本；本发明的引物组合物及检测方法适用范围广、对样本中DNA含量要求极低。CN110541033ACN110541033A权利要求书1/2页1.一种EGFR基因突变的检测用引物组合物，其特征在于：该引物组合物包括突变型引物组合物和/或野生型引物组合物；所述突变型引物组合物包括上游引物F1、上游引物F1-1、水解探针P1和下游引物，其中，所述上游引物F1从5’端至3’端依次包括上游检测区和靶序列结合区：(1)上游检测区从5’端至3’端包括：与F1-1具有相同序列的(a)部分，以及与水解探针P1具有相同序列的(b)部分，及(2)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点，所述扩增决定位点与突变型靶序列上的变异检测位点互补，且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区；所述野生型引物组合物包括上游引物F2、上游引物F2-1、水解探针P2和下游引物；其中，所述上游引物F2从5’端至3’端依次包括上游检测区和靶序列结合区：(1)上游检测区从5’端至3’端包括：与F2-1具有相同序列的(a)部分，以及与水解探针P2具有相同序列的(b)部分，及(2)靶序列结合区的3’端具有扩增决定位点，所述扩增决定位点与野生型靶序列上的变异检测位点互补，且扩增决定位点的上游具有由一个或多个碱基组成的不与靶序列互补的错配区。2.根据权利要求1所述的检测EGFR基因突变的引物组合物，其特征在于：所述下游引物与靶序列上的互补配对的位置设置在变异检测位点下游的1～150bp处。3.根据权利要求1或2所述的检测EGFR基因突变的引物组合物，其特征在于：所述上游引物F1的Tm值与上游引物F1-1的Tm值相差0～20℃；优选地，所述F1的Tm值高于上游引物F1-1的Tm值；所述上游引物F2的Tm值与上游引物F2-1的Tm值相差0～20℃；优选地，所述F2的Tm值高于上游引物F2-1的Tm值。4.根据权利要求1～3任一项所述的检测EGFR基因突变的引物组合物，其特征在于：所述上游引物F1或上游引物F2上的靶序列结合区中错配区长度为1～15个碱基。5.根据权利要求1～4任一项所述的检测EGFR基因突变的引物组合物，其特征在于：所述上游引物F1或上游引物F2上的所述扩增决定位点与上游的错配区距离为1～15个碱基。6.根据权利要求1～5任一项所述的检测EGFR基因突变的引物组合物，其特征在于：所述水解探针P1和水解探针P2的报告基团不同。7.一种EGFR基因突变的检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：(i)提供包括靶核酸的待测样品，对样品进行预处理；(ii)将预处理的样品进行极限稀释并随机分配至770～10000000个反应单元中，随后对所有反应单元进行统一的热循环扩增；(iii)在第一退火温度处，以上游引物F1和/或上游引物F2，与下游引物作为引物对进行靶核酸的预扩增；(iv)在第二退火温度处，以第一引物组合物和/或第二引物组合物继续扩增步骤(iii)中所得的预扩增产物；其中，所述第一引物组合物包括上游引物F1-1、水解探针P1和下游引物，所述第二引物组合物包括上游引物F2-1、水解探针P2和下游引物，所述水解探针P1、水解探针P2带有报告基团；和(v)在步骤(iv)后检测反应体系中报告基团所发出的信号，根据信号对样品中的靶核2CN110541033A权利要求书2/2页酸进行定量；其中，所述上游引物F1从5’端至3’端依次包括上游检测区和靶序列结合区：(1)上游检测区从5’端至3’端包括：与F1-1具有相同序列的(a)部分，以及与水解探针P1具有相同序列的(b)部分，