生物技术制药.pdf

生物技术制药第一章绪论生物技术所含技术范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等基因工程是生物技术的核心和关键细胞工程是生物技术的基础酶工程是生物技术的条件发酵工程是生物技术获得终产品的手段。（他们在生物制药过程中的相互关系自己展开)第二章基因工程制药1.基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体拼接转入新的宿主细胞构建成工程菌实现遗传物质的重新组合并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。2.基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)下游阶段：从工程菌的大量培养直到产品的分离纯化和质量控制3.制备基因工程药物的一般程序目的基因的获得→重组质粒的构建→工程菌的构建→工程菌的培养→产品的分离纯化→过滤（除菌）半成品检验和鉴定→成品检验和鉴定→产品包装、出产4.目的基因的获取途径：a.逆转录法：分离纯化目的基因的mRNA再反转录成cDNA然后进行cDNA克隆表达。真核细胞mRNA有3’-polyAb.反转录-聚合酶链反应法（原理过程步骤药物等自己展开）c.化学合成法5.宿主细胞的分类：①原核细胞常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等；②真核细胞常用的有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞。原核细胞：①大肠杆菌特点:A、大肠杆菌中的表达不存在信号肽故产品多为胞内产物提取时需破碎细胞此时细胞质内其他蛋白也释放出来因而造成提取困难。B、由于分泌能力不足真核蛋白质常形成不溶性的包含体(inclusionbody)表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复姓处理才能恢复其生物活性。C、在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用故对蛋白质产物不能糖基化因此只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质在应用上受到一定的限制。由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基容易引起免疫反应。大肠杆菌会产生很难除去的内毒素还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。②枯草芽孢杆菌：分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中不形成包含体。该菌也不能使蛋白质糖基化另外由于它有很强的胞外蛋白酶会对产物进行不同程度的降解因此它的应用也受到限制。③链霉菌：重要的工业微生物。特点是不致病、使用安全分泌能力强可将表达产物直接分泌到培养液中具有糖基化能力可做理想的受体菌。真核细胞①酵母：繁殖迅速可廉价的大规模培养而且没有毒性基因工程操作与原核生物相似表达产物直接分泌到细胞外简化了分离纯化工艺。表达产物能糖基化。特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因在酵母中表达良好。目前以酿酒酵母应用最多。干扰素和乙肝表面抗原已获成功。②丝状真菌：很强的分泌能力；能正确进行翻译后加工包括肽剪切和糖基化；而且糖基化方式与高等真核生物相似；丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠有成熟的发酵和后处理工艺。6.大肠杆菌中的基因表达（表达载体:Pbv220系统与PET系统区别）1a.表达载体必须具备的条件:①载体能够独立的复制；②具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记。且克隆位点应在启动子序列后