【精选】质粒提取、定量与酶切鉴定.ppt

质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验流程图掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握紫外吸收测定DNA的方法了解质粒酶切鉴定原理掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验材料实验仪器独立于细菌染色体以外能独立自主复制的闭合环状DNA分子基因工程常采用的载体碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法；质粒DNA释放法；酸酚法等碱裂解法基本原理pMD18-T溶液S1（细菌悬浮液）裂解液S2中和液S3洗涤液W洗脱液RNaseA(100mg/ml)DNA吸附柱1取1.5ml培养物加入Eppendorf管中室温离心12000rpm×1min弃上清将离心管倒置使液体尽可能流尽。2加入250μl溶液S1中旋涡振荡使细菌沉淀分散彻底悬浮。3加入250μl裂解液S2颠倒4～6次混匀（不要剧烈振荡）室温静置3min（不超过5min）。4加入350μl中和液S3立即温和颠倒6~8次混匀至出现白色絮状沉淀。5室温12000rpm离心10min。6分次小心取上清液转至吸附柱中（带收集管）每次600μl室温12000rpm离心30s弃滤液将吸附柱重新放回收集管中。7向吸附柱中加入600μl洗涤液W12000rpm离心30s弃滤液。8重复步骤7一次。9空柱10000rpm离心2min。10取出吸附柱放入一个干净的离心管中在吸附膜的中间加50μl56℃预热的洗脱液室温放置1min12000rpm离心1min收集洗脱液（即纯化的质粒DNA）-20℃保存备用。实验流程二、质粒DNA定量测定操作步骤DNA或RNA的定量A260=1.0相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0三、质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II型限制酶其识别位点长度为4～6个核苷酸的反向重复序列。EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：EcoRⅠ：G↓AATTCHindⅢ：A↓AGCTTpMD18-T反应物影响酶切反应的因素四、琼脂糖凝胶电泳电泳：带电粒子在电场中泳动的现象琼脂糖凝胶胶浓度（％）琼脂糖凝胶的制备上样：加样前样品先与6×上样缓冲液混匀电泳：电压100v；30min结果观察：凝胶成像仪琼脂糖凝胶电泳向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液用加样器轻轻混匀；上样：用加样器吸取样品轻轻的加入到凝胶的样品孔中加样量为6µl；盖上电泳槽接通电源开始电泳；电泳条件：电压80v；时间25～30分钟；电泳结束后切断电源取出凝胶。电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带13.取出凝胶置于凝胶成像仪中观察结果并拍照记录。琼脂糖凝胶电泳上样DNAMarker(ladder)LoadingBuffer上样缓冲液染色溴化乙锭(EthidiumBromideEB):38-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐能插入DNA分子碱基对之间并与之结合在紫外光照射下呈现红橙荧光优点：染色操作简便快速；灵敏度高缺点：有致癌性(使用时一定要戴手套)12