质粒提取、定量与酶切鉴定--医学课件.ppt

质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验流程图掌握碱裂解法提取质粒的方法
掌握紫外吸收测定DNA的方法
了解质粒酶切鉴定原理
掌握琼脂糖凝胶电泳技术pMD18-T实验材料实验仪器独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子

基因工程常采用的载体碱裂解法；
煮沸裂解；
羟基磷灰石柱层析法；
质粒DNA释放法；
酸酚法等碱裂解法基本原理pMD18-T溶液S1（细菌悬浮液）
裂解液S2
中和液S3
去蛋白液W1
漂洗液W2
洗脱液
RNaseA(100mg/ml)
DNA吸附柱实验流程二、质粒DNA定量测定操作步骤DNA或RNA的定量
A260=1.0相当于
50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA（或RNA）
20μg/ml寡核苷酸DNA纯品:OD260/OD280=1.8
RNA纯品:OD260/OD280=2.0数据处理三、质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。
分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为4～6个核苷酸的反向重复序列。EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：
EcoRⅠ：G↓AATTC
HindⅢ：A↓AGCTT
pMD18-T反应物影响酶切反应的因素四、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：带电粒子在电场中泳动的现象胶浓度（％）琼脂糖凝胶的制备
上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀
电泳：电压100v；30min
结果观察：凝胶成像仪琼脂糖凝胶电泳向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；
轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；
样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀；
上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6µl；
盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；
电泳条件：电压80v；时间25～30分钟；
电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带
13.取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。琼脂糖凝胶电泳上样DNAMarker(ladder)LoadingBuffer上样缓冲液染色
溴化乙锭(EthidiumBromide，EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,
优点：染色操作简便，快速；灵敏度高
缺点：有致癌性(使用时一定要戴手套)12