【精选】工业微生物育种诱变剂 (2).ppt

第五章工业微生物育种诱变剂2456（一）碱基类似物的诱变机制8910由于5-BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的因此处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。细菌采用对数期的细菌霉菌、放线菌采用孢子但要进行前培养使孢子处于萌动状态并要加大5-BU的浓度处理过程要进行振荡培养。1213（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）真菌、放线菌孢子则要提高5-BU的浓度（0.1—1mg/ml）加到孢子悬液后进行振荡培养数小时(一般6—12h)——分离于平皿——适温培养——挑取单菌落进行筛选。16171819亚硝酸的处理方法如果是处理细菌亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将斜面新鲜菌体移入肉汤培养基适温培养到对数期将培养液进行离心弃去上清液用生理盐水洗涤。pH4.5醋酸缓冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液1:1浓度加入沉淀的菌体中使之悬浮。于35—37℃处理5—10min、加入5倍的pH8.6的磷酸氢二钠溶液使pH下降到6.8。取一定量进行后培养1.5—2h。然后稀释分离于平板上。22羟胺的诱变机制根据诱变机制羟胺不能使突变回复即不能使A:TG:C转换进行逆向突变。由于羟胺是诱发G:CA:T的专一性诱变剂因此可以用来鉴别突变体是A:TG:C还是G:CA:T转换。羟胺的处理方法：常用浓度为0.1—5%可直接在溶液中处理时间1—2h然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中然后接入孢子或细菌在适温下培养生长过程中处理所用浓度比直接处理时低些。——烷化剂是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂这类诱变剂具有一个或多个活性烷基它们易取代DNA分子中活泼的氢原子直接与一个或多个碱基起烷化反应从而改变DNA分子结构引起突变。26烷化剂的诱变机制其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2、腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10%左右。因此由这些位点改变所引起的突变仅是少数。如果鸟嘌呤N7等位点被烷化后它和核糖结合键发生水解反应引起鸟嘌呤从DNA分子上脱落下来使DNA链上碱基空缺在以后的复制过程中其它游离碱基有可能错误掺入。由于烷基化后的鸟嘌呤易离子化由原来的酮式变为不稳定的烯醇式不能和胞嘧啶配对而是与胸腺嘧啶错误配对结果发生G:C——A:T转换而导致突变。烷化鸟嘌呤的碱基配对烷化剂除了以上诱变作用之外还有可能使两个鸟嘌呤N7位点形成共价键一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的交联造成变异或死亡。33烷化剂的性质烷化剂名称几种常用的烷化剂：NTG的水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物从而影响诱变效应。1.取新鲜的斜面用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须进行前培养可用有关培养基代替以上缓冲液孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段经离心、洗涤用缓冲液制成悬液浓度约在106-107ml-1；2.配制NTG母液：由于NTG不溶于水配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许然后加缓冲溶液其比例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml）一般NTG母液浓度配成1mg/ml。使用时取母液0.2ml加菌悬液1.8mlNTG最后处理浓度为100μg/ml。一般处理浓度随菌种不同而异通常细菌为100—1000μg/ml而放线菌、真菌孢子为1000—3000μg/ml。4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤除去药液加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度分离于平皿。NTG是一种强烈的致癌物质操作时要带橡皮手套穿工作服带口罩用称量瓶称量最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理例如用自来水大量冲洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜洗净。424344移码诱变剂的嵌入并不导致突变必须通过DNA的复制才形成突变因此这类诱变剂只能作用于生长态的细胞。分子生物学实验室中利用溴化乙锭能嵌入到DNA分子的特性将其作为常用的DNA染料；在微生物遗传育种中溴化乙锭是酵母菌小菌落突变型的有效诱变剂。46重视化学诱变剂的操作安全485051525354555657585960紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响？哪些修复系统可对此进行修复其结果如何？试述各种诱变剂的作用机制。