基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建方法和试剂.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108504651A(43)申请公布日2018.09.07(21)申请号201710107944.2(22)申请日2017.02.27(71)申请人深圳市乐土精准医疗科技有限公司地址518000广东省深圳市南山区沙河西路深圳湾科技生态园一区2栋C座9层(72)发明人陈建国陈川张静王瑢杨传春张文勇(74)专利代理机构深圳鼎合诚知识产权代理有限公司44281代理人孙银行彭家恩(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C40B50/06(2006.01)权利要求书3页说明书10页序列表3页附图2页(54)发明名称基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建方法和试剂(57)摘要本发明公开了一种基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建方法和试剂。方法包括：将来源于不同样本DNA的多个PCR产物中的每一个，分别与带有标签序列的随机引物进行退火，并在恒温扩增酶的作用下进行恒温扩增反应；将不同样本来源的恒温扩增产物混合，并对混合产物进行片段选择；对片段选择的产物进行5’磷酸化平末端修复和3’末端加A反应；与接头序列连接，以得到能够区分文库信息的连接产物；对连接产物进行PCR扩增，以得到适用于高通量测序的上机文库。本发明不依赖于超声打断仪器；实现混合建库，降低建库成本及复杂度；减少数据浪费，提高测序数据的碱基随机性、覆盖深度均一性，从而降低单个样本的测序成本。CN108504651ACN108504651A权利要求书1/3页1.一种基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建方法，其特征在于，包括：(1)将来源于不同样本DNA的多个PCR产物中的每一个，分别与带有标签序列的随机引物进行退火，并在恒温扩增酶的作用下进行恒温扩增反应，得到能够区分样本来源的恒温扩增产物，其中所述带有标签序列的随机引物的序列结构如下：X(m)N(n)，其中X(m)表示标签序列，其长度为4～15个碱基，用于区分样本来源；N(n)表示随机碱基序列，其长度为6～10个碱基，用于与所述PCR产物随机结合；(2)将不同样本来源的恒温扩增产物混合，并对混合产物进行片段选择；(3)对所述片段选择的产物进行5’磷酸化平末端修复和3’末端加A反应，以得到具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；(4)将所述DNA片段与接头序列连接，以得到能够区分文库信息的连接产物，其中所述接头序列含有用于区分文库的条形码序列；(5)对所述连接产物进行PCR扩增，以得到适用于高通量测序的上机文库。2.根据权利要求1所述的文库构建方法，其特征在于，所述标签序列X(m)长度为6个碱基，所述随机碱基序列N(n)长度为6个碱基。3.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR产物是目标区域特异性PCR产物。4.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR产物是单重或者多重PCR反应的产物，其长度大于400bp。5.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR产物的量是10-50ng。6.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述标签序列X(m)选自如下标签01至标签48所示的序列中任意一个：2CN108504651A权利要求书2/3页7.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的恒温扩增酶是phi29DNA聚合酶。3CN108504651A权利要求书3/3页8.根据权利要求1或2所述的文库构建方法，其特征在于，所述接头序列包括正链和负链，其中所述正链如SEQIDNO：1所示的序列，所述负链如SEQIDNO：2所示的序列，5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQIDNO：1)；5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’(SEQIDNO：2)，其中NNNNNNNN表示所述条形码序列。9.一种基于高通量测序的PCR产物大样本量混合建库的文库构建试剂盒，其特征在于，包括：带有标签序列的随机引物，其序列结构如下：X(m)N(n)，其中X(m)表示标签序列，其长度为4～15个碱基，用于区分样本来源；N(n)表示随机碱基序列，其长度为6～10个碱基，用于与所述PCR产物随机结合；所述带有标签序列的随机引物分别用于与来源于不同样本DNA的多个PCR产物中的每一个进行退火，并在恒温扩增酶的作用下进行恒温扩增反应，以便得到能够区分样本来源的恒温扩增产物。10.根据权利要求9所述的文库构建试