水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108950026A(43)申请公布日2018.12.07(21)申请号201810578490.1(22)申请日2018.06.07(71)申请人镇江德威乐普能源环保科技有限公司地址212000江苏省镇江市丹徒区智慧南大道162号(72)发明人李冠霖侯艳娇邵世和邵岩(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/10(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12R1/63(2006.01)C12R1/01(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法(57)摘要本发明公开了一种可同时快速检测水样中志贺氏菌（shigellaspp）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersiniaenterocolitica）与副溶血性弧菌（VibrioParahemolyticus）的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法。本发明属于水样中感染性疾病的分子诊断技术领域，拟解决水样中病原菌的快速诊断。本发明设计了志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌的特异性引物，并建立了可同时检测这些细菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌感染的快速诊断与流行病学调查。CN108950026ACN108950026A权利要求书1/1页1.一种水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌阳性对照DNA，志贺氏菌引物，小肠结肠炎耶尔森菌引物，副溶血性弧菌引物。2.根据权利要求1所述的多重降落PCR检测试剂盒，其特征在于所用的志贺氏菌引物序列为：5’-CGCCATATCAGAGTCATCACT-3’与5’-TGCGTGCAGAGACGGTAT-3’。3.根据权利要求1所述的多重降落PCR检测试剂盒，其特征在于所用的小肠结肠炎耶尔森菌引物序列为：5’-ACCACGGCAATAGTTCTAATC-3’与5’-CGGCAACAATATCAGATGGAGA-3’。4.根据权利要求1所述的多重降落PCR检测试剂盒，其特征在于所用的副溶血性弧菌引物序列为：5’-TACGCTGAAGATAAACTAACGG-3’与5’-TGCGGAAGAAGACTTACGAG-3’。5.一种水中病原菌多重降落PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（一）提取待检样本的DNA（二）多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的VP1332、inv基因与ipaH序列，具体步骤如下：反应体系：25µl，包括H2O7.65µl，缓冲液（10×PCR）2.5µl，BSA（10mg/ml）0.25µl，VP_VP1332-F（10µmol/L）0.2µl，VP_VP1332-R（10µmol/L）0.2µl，Ye_inv-F（10µmol/L）3µl，Ye_inv-R（10µmol/L）3µl，Sh_ipaH-F（10µmol/L）0.2µl，Sh_ipaH-R（10µmol/L）0.2µl，MgCl（252mM）2.5µl，dNTP（2.5mM）3µl，TaqDNA聚合酶（5U/µl）0.3µl，DNA模板2µl引物：志贺氏菌引物为：Sh_ipaH-F：5’-CGCCATATCAGAGTCATCACT-3’Sh_ipaH-R：5’-TGCGTGCAGAGACGGTAT-3’小肠结肠炎耶尔森菌引物为:Ye_inv-F：5’-ACCACGGCAATAGTTCTAATC-3’Ye_inv-R：5’-CGGCAACAATATCAGATGGAGA-3’副溶血性弧菌引物为：VP_VP1332-F：5’-TACGCTGAAGATAAACTAACGG-3’VP_VP1332-R：5’-TGCGGAAGAAGACTTACGAG-3’（三）PCR反应循环参数如下：94℃5min；94℃30s,61℃（每循环降低0.5℃）30s,72℃1min，20个循环；94℃30s,51℃30s,72℃1min,20个循环；72℃7min（四）电泳检测鉴定：对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有870bp、393bp、193bp条带则分别代表检出副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌。2CN108950026A说明书1/4页水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及水样中感染性疾病的分子诊断技术领域，具体涉