鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究.docx

鼠胚胎干细胞定向诱导为角膜上皮细胞的实验研究[摘要]目的建立能够稳定表达绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）的鼠胚胎干细胞系并研究体外诱导鼠胚胎干细胞（embryonicstemcellEs细胞）向角膜上皮细胞分化的可能性及条件为角膜损伤提供新型的上皮修复组织来源。方法质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠胚胎干细胞对稳定表达GFP的ES细胞以Ⅳ型胶原作为诱导条件定向诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞转化观察培养后形态改变免疫荧光及RT-PCR检测K12、K14及CD44的表达。结果转染后ES细胞稳定表达GFP成功诱导出角膜上皮样细胞呈典型上皮样细胞形态免疫组化及RT-PCR检测显示K12及CD44表达阳性K14表达阴性。结论转染GFP的ES细胞在Ⅳ型胶原的诱导下成功向角膜上皮细胞分化。[关键词]胚胎干细胞；绿色荧光蛋白；分化；角膜上皮细胞；诱导[中图分类号]R329.2[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2013）03（b）-0013-03角膜上皮位于眼角膜表面是维持眼表正常生理功能的重要条件。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。人的角膜自我更新由位于角膜缘外围区域的角膜缘干细胞来维持结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源当角膜受到化学及热烧伤以及患有Stevens-Johnsonsyndrome等疾病时角膜缘上皮细胞将会缺失导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。因此重建完整的角膜上皮就显得异常重要。胚胎干细胞（embryonicstemcellsES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）基因是一种新型的报告基因用GFP作为标志物来标记ES细胞可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。1材料与方法1.1实验材料鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸购自Sigma公司；丝裂霉素C购自Kogyo公司；脂质体Lipofectamine2000、G418均购自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemiainhibitoryfactorLIF）、L-谷氨酰胺购自Sigma公司；质粒pEGFP-N1购自Clontech公司；明胶、TaqDNA聚合酶购自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物委托宝生物工程公司合成；免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；其余为国产分析纯试剂。1.2实验方法1.2.1ES细胞的培养ES细胞复苏后经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层培养加入预先铺有明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中37℃50mL/LCO2培养箱中培养每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM（内含0.1mol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、150mL/L胎牛血清、1000U/mLLIF、15g/L非必需氨基酸）。2～3d传代1次。1.2.2转染及诱导ES细胞将真核细胞表达载体pEGFP-N1转染ES细胞作为实验组空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2h改为无血清的DMEM培养液；含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM培养液与含脂质体Lipofectamine2000的无血清DMEM培养液混合加入ES细胞培养皿中置37℃的CO2培养箱中培养换液培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上继续扩增培养获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞接种于涂抹明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中加入无LIF的ES细胞培养液隔日换液传3～4代诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。1.2.3形态学和免疫组织化学鉴定显微镜下观察ES细胞形态诱导培养7d后细胞基本融合将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后冷4%多聚甲醛固定30min正常山羊血清封闭30min滴加K14、K12及CD44单抗4℃过夜0.02%Triton-PBS洗涤加人生物素标记的二抗室温下孵育40minPBS洗涤数次后加入链亲和素一过氧化物酶溶液放置于室温下10min0.02%Tr