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诱导小鼠多能干细胞分化为角膜上皮细胞的实验研究
引言:
近年来，干细胞技术在医学领域得到了广泛应用，成为一项备受关注的研究领域。干细胞可以不断自我更新并具有多向分化能力，其治疗潜力在不断的扩大。干细胞治疗具有很多优势，如高效性、安全性等。因此，人们期望能通过干细胞治疗（transplantation）的方式来治疗更多疾病，尤其是全身性疾病。
干细胞的分化能力十分强大。通过在一定条件下，不同的干细胞可以分化成人体各种不同的组织，如皮肤、神经组织、心脏等。近年来研究表明，角膜上皮细胞和干细胞的相互关系比较紧密。而角膜缺陷目前在眼科领域中是一个难题，通过干细胞可以实现角膜替代，从而实现治疗这种疾病的目标。
本文将通过对小鼠多能干细胞在角膜细胞中的诱导分化实验进行探讨，希望能为近期的干细胞技术在治疗角膜缺陷上进行基础研究。
实验材料与方法
材料：
小鼠多能干细胞(mESCs)
20%FBSMEMa
DMEM/F12medium(Gibco)
80%DMEMHighGlucosemedium
10mMbFGF(Roche)
20µg/mlinsulin(Sigma)
100µg/mltransferrin
20µMpotassiumchloride
100µMnonessentialaminoacids
1%N2supplement
2.5%B27supplement
RT-PCRassay
磷酸酸化酰化的Akt（p-AktSer473）和Akt（AktSer473）
抗α-尿激酶（p-ERK1/2（T202/Y204））
方法：
1.细胞培养和诱导
mESCs首先在凝胶银和凝胶酵母提取物中的胶原质表面上进行细胞培养。
将细胞培养液中的mESCs通过细胞培养进行扩增（采用传代技术）
将mESCs细胞培养液中加入bFGF,Insulin,Transferrin等不同荷尔蒙。
诱导mESCS分化为成上皮细胞。
2.酸碱度检测
细胞培养寿命为10~14天时，测定光密度。
用PH计检测培养液中的PH值。
3.Real-timePCR
转录RNA段
荧光定量PCR
数据分析
分析小鼠多能干细胞在角膜上皮细胞中的诱导分化。
结果
1.诱导mESCS分化为成上皮细胞。
在加入不同荷尔蒙，如：bFGF，Insulin，Transferrin等荷尔蒙的诱导下实现了小鼠多能干细胞的分化，具有形态上的变化，从而证明了荷尔蒙的诱导作用。
2.酸碱度检测
在细胞培养寿命为10~14天时，我们测定了细胞密度和pH。结果表明，细胞密度和PH明显变化，这表明动物细胞在生长和分化时，细胞产生的代谢酸和碱可以影响初始培养基的酸度，从而调整生理碱性/酸性的均衡。
3.Real-timePCR数据分析
我们采用荧光定量PCR技术进行分析，这基本能够检测到不同基因的表达。我们发现在实验过程中，mESCS可以分化成角膜上皮细胞，并且发现相关的上皮细胞标记的基因表达量均有所增加。
讨论和结论
通过上述实验结果可以看出，小鼠多能干细胞可以在角膜上皮细胞的诱导下分化。这为治疗角膜缺陷病提供了新的研究方向。本实验是基础研究，其他的细胞生物学、分子生物学研究及细胞治疗方案还需要多方面开展见多了解。这些结果表明，干细胞在临床上的治疗潜力非常巨大。