人乳头瘤病毒HPV35 L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116102627A(43)申请公布日2023.05.12(21)申请号202211702926.6C12N15/70(2006.01)(22)申请日2022.12.28C12N1/21(2006.01)C07K1/22(2006.01)(71)申请人北京康乐卫士生物技术股份有限公C07K1/18(2006.01)司C12R1/19(2006.01)地址100176北京市大兴区经济技术开发区荣昌东街7号A2幢201-202(72)发明人伍树明刘永江陈晓高文双王学红张海江沈迩萃薛俊莲张尧陈丹银飞王建英(74)专利代理机构北京知文通达知识产权代理事务所(普通合伙)16051专利代理师欧阳石文(51)Int.Cl.C07K14/025(2006.01)C12N15/37(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称人乳头瘤病毒HPV35L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法(57)摘要本发明涉及医药生物领域，具体涉及人乳头瘤病毒L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。对HPV35型L1蛋白的氨基酸序列进行截短，并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列，最后配合含有特定SD序列无标签表达载体实现无标签表达纯化。本发明通过上述改进使得在原核表达系统例如大肠杆菌表达系统中可以获得更高的蛋白表达量，且得到质量更均一的VLP。CN116102627ACN116102627A权利要求书1/1页1.一种截短的HPV35型L1蛋白，其是在野生型HPV35型L1蛋白的基础上，在其N端截短不多于10个氨基酸，优选4个氨基酸，且在其C端截短不多于30个氨基酸，优选28个氨基酸；优选地，截短的HPV35型L1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码如权利要求1所述的截短的HPV35型L1蛋白的核酸；优选地，其经过密码子优化的核酸；更优选地，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有SD序列和编码如权利要求2所述的核酸，优选地，所述SD序列的核苷酸序列为5`‑AGGAGGAATTA‑3`。4.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体。5.如权利要求4所述的表达盒或表达载体，其特征在于，其是原核表达载体，更优选地是在载体pGEX基础上去除了GST标签序列，并且整合所述SD序列的截短的HPV35型L1蛋白的核酸分子而得到。6.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体的重组宿主细胞。7.如权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，其是原核细胞，优选为大肠杆菌。8.一种表达如权利要求1截短的HPV35型L1蛋白的方法，其特征在于，培养如权利要求6或7所述的重组宿主细胞以产生HPV35型L1蛋白，任选地，包括纯化步骤，优选地所述纯化步骤为：取所述的重组宿主细胞的菌体用破菌缓冲液充分重悬，然后用高压均质机对菌体进行高压破碎，离心收集上清；上清进一步通过硫酸铵沉淀，硫酸铵的最终饱和度为30%，沉淀复溶后再次离心收集上清获得粗纯液；粗纯液先上样进行Superdex200分子筛层析，根据L1目的蛋白的出峰位置收集其所在组分；接着将分子筛收集样品上样进行Source15Q阴离子交换层析，通过NaCl线性洗脱收集L1目的蛋白所在组分，得到HPV35型L1蛋白。9.一种表达如权利要求1截短的HPV35型L1蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：根据如权利要求8所述的方法得到的HPV35型L1蛋白的步骤，调节其所在缓冲液的pH和盐浓度，使其自组装形成VLP。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，醋酸缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液，枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液，硼酸缓冲液，优选磷酸盐缓冲液；缓冲液的PH在4.75‑5.25，盐浓度在2.0‑4.0M之间，优选PH4.75，PH5.0，PH5.25；其中的盐浓度在2.0‑4.0M之间，优选2.0M，2.5M，3.0M，3.5M，4.0M；任选地，还包括纯化所得HPV35L1五聚体的步骤。2CN116102627A说明书1/6页人乳头瘤病毒HPV35L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及医药生物领域，具体涉及人乳头瘤病毒L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。更具体涉及人乳头瘤病毒HPV35L1蛋白VLP（类病毒样颗粒）的构建及表达。背景技术[0002]人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过2